Estudio de las relaciones metabólicas y funcionales entre la serotonina y la melatonina en la glándula pineal de mamíferosaplicación de técnicas de microdialisis in vivo

Resumen

La Vida en la Tierra ha desarrollado una amplia variedad de sistemas de organización temporal que continuamente ajustan la fisiología del organismo de forma eficiente con las variaciones ambientales rítmicas. Las variaciones rítmicas de las funciones biológicas constituyen auténticos ritmos biológicos, con una clara persistencia en condiciones ambientales constantes, lo que indica la presencia de un oscilador o reloj endógeno interno que controla la periodicidad del ritmo. En los mamíferos, hay claras evidencias de que el núcleo supraquiasmático (NSQ) contiene el oscilador circadiano que controla la mayoría de los ritmos del organismo. Estos ritmos son elaborados, sincronizados y transmitidos por estructuras nerviosas integradas en el eje retinohipotálamico- pineal, el cual en última instancia, controla la secreción rítmica de melatonina en la glándula pineal, que presenta un claro ritmo circadiano en su síntesis y secreción, con elevados niveles de melatonina circulante durante la noche y bajos, casi nulos, durante el día. Existen claras evidencias de que la noradrenalina (NA) es el principal neurotransmisor liberado por las neuronas postganglionares simpáticas que inervan la glándula pineal en mamíferos. El aumento nocturno de la NA interactúa con receptores a- y b- adrenérgicos de la membrana de los pinealocitos, lo que resulta en una acumulación intracelular de AMPc y un subsiguiente aumento en la actividad del enzima arilalquilamina-N-acetiltransferasa (AANAT) y en la síntesis de melatonina. Los estudios sobre el control de la actividad pineal, particularmente la síntesis de melatonina, se han centrado sobre todo en la actividad de los enzimas AANAT y hidroxindol -O- metiltransferasa (HIOMT), aunque en los últimos años también se ha hecho hincapié en la actividad de la Triptófano hidroxilasa (TP-OH). La glándula pineal sintetiza diferentes indolaminas entre las cuales destaca la serotonina (5-HT), cuya concentración en la glándula es la mayor encontrada en una estructura cerebral. La 5-HT aparte de ser el sustrato para la síntesis de melatonina, podría mediar diversas acciones reguladoras de la actividad pineal. Básicamente, esta hipótesis se sustenta en cuatro supuestos: 1) la disponibilidad intracelular de 5-HT pineal está relacionada con su síntesis y con su uso en diferentes rutas metabólicas; 2) el contenido de 5-HT intracelular podría ser limitante para la formación de melatonina nocturna; 3) una parte de la 5-HT pineal puede ser liberada al medio extracelular y 4) la 5-HT extracelular puede ejercer algún tipo de acción moduladora sobre la síntesis de melatonina. OBJETIVOS Estudiar las relaciones metabólicas y funcionales entre la 5-HT y melatonina a lo largo del ciclo día/noche, así como el posible papel modulador de la 5-HT pineal, particularmente aquella presente a nivel extracelular, en la formación de melatonina en la glándula pineal de la rata. 2 MATERIAL Y MÉTODOS En todos los trabajos experimentales se utilizaron ratas macho de la raza Sprague- Dawley que fueron acondicionadas durante al menos las dos semanas previas a cualquier experimento y bajo un ciclo de luz-oscuridad específico que varió en función del experimento a realizar. En todo momento tuvieron acceso libre a agua y comida (temperatura de 21 ± 1º). El manejo de los animales se llevó a cabo según la legislación española: Real Decreto 1201/2005 del 10 de octubre sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos (BOE nº 252 del 21 de octubre). TRABAJO EXPERIMENTAL 1: Ritmos diarios del contenido de catecolaminas, indolaminas y melatonina en la glándula pineal de la rata. Objetivo: estudiar en detalle las variaciones a lo largo del ciclo fotoperiódico diario del contenido de diferentes catecolaminas, indolaminas y melatonina en la glándula pineal así como las principales actividades enzimáticas implicadas en la ruta de síntesis de melatonina, la TP-OH y la AANAT. ¿ Material y métodos La cuantificación de las actividades de la AANAT y de la TP-OH, así como el contenido de melatonina, se llevaron a cabo mediante un sistema cromatográfico de HPLC con detección fluorimétrica, mientras que el análisis del contenido de noradrenalina (NA), dopamina (DA), 5-hidroxitriptófano (5-HTP), 5-HT, ácido 5- hidroxiindolacético (5-HIAA) y N-acetilserotonina (NAS) se realizó mediante detección culométrica. Los animales fueron sacrificados por decapitación en distintos momentos del ciclo día/noche, prestando especial atención a las fases de transición luz-oscuridad y oscuridad-luz (encendido de la luces a las 08:00 horas, apagado a las 20:00h). ¿ Resultados y discusión Los datos obtenidos midiendo los ritmos diarios del contenido de diversos indoles y metoxindoles pineales, así como el análisis de la actividad AANAT y TP-OH, resaltan el papel central de la 5-HT en la actividad rítmica pineal. El elevado contenido de esta amina ha sido considerado como un almacén de sustrato para la síntesis de melatonina, hecho que es avalado porque su ritmo diario es claramente opuesto al de melatonina. Sin embargo, esta podría no ser solo su función dado que durante las transiciones luz/oscuridad y oscuridad/luz no existe una buena correlación entre el contenido de ambos compuestos. Los resultados obtenidos descartan que el uso de 5-HT en rutas metabólicas de no N-acetilación sea causante de tales discrepancias y apuntan a que otros procesos, tales como la liberación de 5-HT al medio extracelular, puedan jugar algún papel regulando el contenido intrapinealocitarios de 5-HT. Los resultados también resaltan la importancia que podría tener la síntesis de 5-HT como un factor de regulación de la disponibilidad de 5-HT para la formación de melatonina durante la noche. 3 TRABAJO EXPERIMENTAL 2: Papel de la síntesis de 5-HT en la regulación de la producción de melatonina en la glándula pineal. Objetivo: determinar hasta que punto las alteraciones de la síntesis de 5-HT y de su disponibilidad en las células pineales pueden condicionar la producción de melatonina. ¿ Material y métodos Los animales fueron acondicionados a un fotoperiodo de luz-oscuridad de 12:12 horas (encendido de las luces a las 8:00 horas) y distribuidos en tres grupos diferentes según el tratamiento: 1) administración de benserazida (inhibidor de la Laminoácido decarboxilasa) (LAAD) durante el día y la noche; 2) isoproterenol (ISO) (agonista de receptores b-adrenérgicos); 3) isoproterenol + benserazida (día); 4) administración de L-triptófano (L-Trp) (día/noche). Los animales se sacrificaron por decapitación a una, tres y seis horas tras el tratamiento. Las condiciones de los ensayos de la actividad de la AANAT y las determinaciones analíticas de los niveles de NA, DA, 5-HT, 5-HIAA, 5-HTP, NAS y melatonina en las glándulas pineales se realizaron siguiendo los procedimientos cromatográficos descritos en el primer trabajo. ¿ Resultados y discusión Los resultados demuestran que la administración de benserazida resulta en un aumento de los niveles de 5-HTP y descenso en el contenido de 5-HT, 5-HIAA, NAS y melatonina, tanto de día como de noche. El tratamiento con ISO presentó efectos dosis-dependiente sobre los niveles de NAS y melatonina, en paralelo al incremento de la actividad AANAT pineal. Asimismo, el bloqueo con benserazida de la LAAD en animales tratados con ISO provocó un fuerte aumento dosisdependiente del contenido de 5-HTP, a la vez que redujo los niveles de 5-HT y 5- HIAA. Por otra parte, la administración de L-Trp estimula la producción de melatonina pineal durante el día, sugiriendo que en estas circunstancias, la disponibilidad de 5-HT podría ser un factor limitante de la formación de melatonina. Durante la noche no se evidencia dicho efecto estimulador del triptófano, a pesar del fuerte aumento de concentración de 5-HT pineal. Además, los hallazgos indican que los efectos del L-Trp tienen lugar sin alteración alguna de la transmisión adrenérgica pineal, dado que ni de día ni de noche, se produjeron alteraciones en los niveles de NA/DA, ni en la actividad AANAT que podría resultar afectada si dichos cambios tuviesen lugar. Todo ello refuerza la idea de que la disponibilidad de sustrato utilizable por la AANAT podría ser un factor que contribuyese a limitar la síntesis de melatonina en la glándula pineal de la rata, particularmente durante el día. 4 TRABAJO EXPERIMENTAL 3: Puesta a punto de una técnica de microdiálisis para el estudio in vivo de la liberación de melatonina en la glándula pineal de la rata. Evaluación mediante microdiálisis de los cambios diarios de los niveles extracelulares de indoles y melatonina en la glándula pineal de la rata en libre movimiento. Objetivo: evaluar las fluctuaciones diarias de la liberación de melatonina e indoles pineales en la rata en libre movimiento y profundizar en la comprensión de la interacción funcional entre el principal producto de la glándula pineal, la melatonina, y su precursor metabólico, la serotonina. ¿ Material y métodos Los animales se expusieron a: 1) un fotoperiodo en el que se invirtieron las fases de luz y oscuridad, apagado de las luces: 10:00 h y el encendido: 20:00 h. en el experimento de la liberación in vivo de indoles y melatonina, y 2) a una situación lumínica de fotociclo normal, encendido: 08:00 h y apagado a las 22:00 horas en el experimento de comprobación de la eficacia del sistema de microdiálisis pineal en la respuesta a fármacos aplicados de forma local. Las condiciones de los ensayos de la actividad de la AANAT y las determinaciones analíticas de los niveles de NA, DA, 5-HT, 5-HIAA, 5-HTP, NAS y melatonina en las glándulas pineales se realizaron siguiendo los procedimientos cromatográficos descritos en el primer trabajo. ¿ Resultados y discusión La técnica de microdiálisis adaptada a la glándula pineal mediante el desarrollo de una sonda específica elaborada en nuestro laboratorio (sonda en L), presenta la ventaja de permitir mediante una inserción lateral y hemicerebral alcanzar la glándula pineal con relativa facilidad y seguridad. Con este procedimiento, y las técnicas de HPLC descritas previamente, se ha podido monitorizar de forma continua los niveles extracelulares de 5-HT, 5-HIAA, NAS y melatonina durante dos días consecutivos en la rata en libre movimiento. Se observó un patrón similar para NAS y melatonina, y otro patrón similar para 5-HT y 5-HIAA. Con una correlación inversa entre la 5-HT extracelular (baja durante la noche y elevada durante el día) y la melatonina y la NAS (bajas durante el día y elevadas durante la noche), con la nota discordante del aumento puntual de la 5-HT al inicio de la noche, que no tuvo su reflejo en aumentos simultáneos de los niveles de NAS y melatonina. Además, nuestros estudios también revelan un claro ritmo de 5-HT extracelular con un patrón trifásico dado que: i) los niveles diurnos son relativamente elevados, pero aumentan todavía más (50-60% sobre los valores de día) durante las 2-3 primeras horas de oscuridad, ii) disminuyen a media noche y permanecen bajos durante varias horas, iii) inician un aumento aproximadamente una hora antes del comienzo de la fase de luz. 5 TRABAJO EXPERIMENTAL 4: Efecto de la administración de antagonistas y agonistas serotoninérgicos sobre el contenido de melatonina pineal. Objetivo: estudiar el efecto de los diferentes agonistas y antagonistas de receptores 5-HT2, que se indican a continuación: 1) Ketanserina, antagonista selectivo 5-HT2A/2C; 2) SDZ-SER 082, antagonista selectivo 5-HT2B/2C; 3) a-metil-5-HT, agonista no selectivo 5-HT2 y 3) DOI, agonista selectivo 5-HT2A/2C. Así como la administración conjunta de L-trp con ketanserina y con SDZ SER. ¿ Material y métodos Los animales fueron acondicionados a un ciclo de luz/oscuridad (L:O) de 12:12 horas (encendido de las luces a las (8:00 horas). Se determinó el efecto de los tratamientos con agonistas y antagonistas previamente citados, sobre la actividad del enzima AANAT y los niveles de melatonina que se analizaron siguiendo los procedimientos descritos en el trabajo experimental 1. ¿ Resultados y discusión La administración i.p. al inicio de la noche de ketanserina y SDZ-SER 082 provocó un descenso de los niveles de melatonina pineales, observándose también un descenso en la actividad AANAT lo que sugiere que el efecto negativo de ambos fármacos sobre la formación de melatonina se debió a una atenuación del aumento de la actividad AANAT. El efecto de la ketanserina y de SDZ SER 082 en animales tratados simultáneamente con L-Triptófano, produjo una inhibición de la producción nocturna de melatonina en comparación con el grupo que recibió solo el L-Trp, hecho que fue más notorio con el SDZ SER 082, el cual también inhibió la actividad AANAT. Por otra parte, ni la administración de a-metil-5HT (agonista 5-HT2 no selectivo), ni de DOI (potente agonista de receptores 5-HT2A/C) produjeron efectos significativos sobre la actividad del enzima AANAT y el contenido de melatonina. TRABAJO EXPERIMENTAL 5: modulación serotoninérgica de la síntesis de melatonina in vivo. Papel de los receptores 5-HT2 pineales. Objetivo: estudiar mediante microdiálisis el posible papel que juegan los receptores 5- HT2 pineales en la producción nocturna de melatonina en la rata en libre movimiento, valorando la respuesta de dicho proceso a diferentes antagonistas serotoninérgicos. ¿ Material y métodos Los animales fueron acondicionados a un fotoperiodo invertido de luz/oscuridad de 14/10 horas, con apagado de las luces a las 10:00 horas y encendido de las mismas a las 20:00 horas. Los procedimientos de microdiálisis pineal y las determinaciones analíticas de los niveles de 5-HT, NAS y MEL fueron llevados a cabo tal y como se detalla en el Trabajo Experimental 3. Los tratamientos con ketanserina y SDZ SER 082, se administraron vía intracánula durante el segundo 6 día de monitorización. Esos mismos animales recibieron durante el primer día un tratamiento similar pero que contenía solo el LCRa en el que se disolvieron los fármacos (control). ¿ Resultados y discusión La ketanserina administrada durante 3 horas y 6 horas al principio de la noche provocó una fuerte caída de la producción de melatonina, que se concretó en un descenso en los niveles extracelulares de NAS y de la propia melatonina. También la aplicación local del SDZ SE 082 tuvo un efecto reductor de la liberación de NAS y melatonina, aunque mucho menor que el promovido por la aplicación de ketanserina. Estos resultados apoyan la posibilidad de que la 5-HT liberada al medio extracelular pineal al inicio de la noche sirva como una señal potenciadora de la producción de melatonina. Dicho efecto sería mediado por receptores 5-HT2 (presumiblemente del subtipo 5-HT2A) y ocurriría principalmente en las primeras horas de la noche promoviendo una mayor activación de la enzima AANAT. CONCLUSIONES 1. El contenido de indoles y melatonina en la glándula pineal de la rata presenta fuertes variaciones cíclicas diarias motivadas por el aumento brusco y mantenido de la actividad AANAT durante la noche, la cual responde a la liberación de NA desde las terminales simpáticas que inervan la glándula. El pico nocturno de AANAT es responsable del aumento de síntesis de melatonina, pero también del fuerte descenso de los niveles de 5-HT. Esta amina es utilizada prioritariamente en la vía de N-acetilación durante la noche, en detrimento de su uso oxidativo que predomina durante el día. 2. Se ha demostrado la importancia de una síntesis elevada y continua de 5-HT en el metabolismo y función de la glándula pineal. La inhibición de la síntesis de 5-HT anula la síntesis basal de melatonina durante el día y supone un serio handicap para producir unos niveles óptimos de melatonina durante la noche. Dado que la TP-OH pineal duplica su actividad nocturna, podemos considerar a este enzima como un factor clave para mantener unos niveles óptimos de 5- HT, que serán utilizados para formar una cantidad adeduada de melatonina en respuesta a la estimulación adrenérgica de la glándula. 3. La dinámica de uso de la 5-HT pineal es notoriamente diferente durante el día y la noche, como también lo es su disponiblidad citoplasmática para formar melatonina. Durante el día, la disponibilidad de 5-HT está asegurada por su síntesis de novo, de forma que si esta se inhibe se reduce la producción de melatonina, y si se estimula, se aumenta la producción de melatonina. Durante la noche, sin embargo, parece existir una movilización de 5-HT desde un pool citoplasmático que no estaría tan afectado por la síntesis de novo, pero que resultaría fundamental para la formación rápida de grandes cantidades de melatonina. 7 4. Mediante una técnica de microdiálisis pineal se ha demostrado la existencia de una liberación continua diaria de serotonina, NAS y melatonina, la cual fue monitorizada durante 2 días consecutivos. El contenido extracelular pineal de estos compuestos muestra una elevada variación interindividual que podría estar en relación con aspectos técnicos o bien con características propias de cada individuo. 5. La cantidad de NAS liberada desde los pinealocitos durante la noche es comparable con la de melatonina, lo que indica que el incremento nocturno de la actividad del enzima AANAT es imprescindible, pero no estrictamente limitante, de la cantidad de melatonina formada. En este sentido, los resultados apoyan que la enzima HIOMT tenga un papel importante limitando la amplitud del pico nocturno de melatonina. 6. Se ha demostrado un aumento de la concentración de 5-HT extracelular pineal al inicio de la noche, coincidiendo con la fase de subida del pico de melatonina. Dicho aumento proviene de una mayor liberación de la 5-HT, la cual está asociada a una elevada síntesis intracelular promovida por la estimulacion noradrenérgica de la glándula. El hecho de que al inicio de la noche se asocien aumentos de síntesis, disponibilidad citoplasmática y liberación de 5-HT, junto con un incremento de la síntesis de melatonina, lleva a pensar que existe un vínculo funcional (mas allá del puramente metabólico) entre dichos procesos. 7. La administración de antagonistas serotoninérgicos afecta negativamente a la formación de melatonina pineal. Este efecto es mayor cuando se aplican localmente a través de la sonda de microdiálisis que cuando se administrán por vía sistémica, lo que refleja que es mediado por mecanismos locales de la glándula. Se han presentado evidencias de que estos mecanismos involucran receptores del subtipo 5-HT2A, aunque no se puede descartar que también participen los receptores del subtipo 5-HT2C. El bloqueo farmacológico de estos receptores (particularmente los 5-HT2A) reduce fuertemente la secreción nocturna de melatonina. 8. La 5-HT extracelular pineal juega podría tener un papel modulador de la síntesis de melatonina, el cual parece ser más destacable durante las primeras horas de la noche cuando tiene lugar el aumento de la actividad AANAT. Es probable que los mecanismos intracelulares que median el efecto de la 5-HT extracelular sean comunes a los que participan en la regulación adrenérgica de la síntesis de melatonina. De esta forma, la activación nocturna de los receptores serotoninérgicos contribuiría a potenciar el aumento de la actividad AANAT y la producción de melatonina pineal durante la noche.