Estrategias operacionales para mejorar la estabilidad plasmídica y expresión en fermentaciones con levaduras recombinantes

Resumo

En esta tesis doctoral se han desarrollado una serie de estrategias de tipo operacional para mejorar la estabilidad plasmídica y la expresión genética de levaduras recombinantes. Como microorganismo modelo se ha utilizado una cepa modificada genéticamente de la levadura Saccharomyces cerevisiae que sobreexpresa el gen homólogo EXG1, el cual codifica la síntesis del enzima exo-beta-glucanasa. La caracterización cinética y fisiológica de este microorganismo permitió observar que las células que no portan copias del plásmido tienen una velocidad específica de crecimiento tres veces mayor. Por otro lado, se observaron notables diferencias en la distribución y concentración de los productos de fermentación en cultivos con microorganismos que no portan plásmido y cultivos con células recombinantes, debido a la alteración de los flujos metabólicos provocada por la modificación genética inducida. También se estudió el efecto de algunas variables de operación como la concentración inicial de sustrato, biomasa y la velocidad de agitación, en procesos en discontinuo, así como el efecto del porcentaje de oxígeno disuelto en cultivos continuos, sobre la actividad del enzima recombinante. La caracterización del microorganismo recombinante, empleando técnicas de citometría de flujo, microscopía electrónica de barrido y microscopía confocal láser, ha permitido observar diferencias morfológicas y fisiológicas importantes con respecto a las células que no portaban plásmido, revelándose como herramientas de gran utilidad para la monitorización de procesos llevados a cabo con estos microorganismos. Dos de las estrategias planteadas fueron la operación en reactores fed-batch con alimentación intermitente y alimentación continua. Los resultados obtenidos con estas estrategias indican que mediante la alimentación intermitente se conseguía mejorar tanto la estabilidad plasmídica como la expresión enzim