Caracterización de la proteína no estructural μNS de reovirus aviar

Résumé

Los reovirus aviares pertenecen al género Ortoreovirus, uno de los 12 géneros de la familia Reoviridae. Estos virus carecen de envoltura lipídica y replican en el citoplasma de la célula hospedadora. Poseen una doble cubierta proteica de 85 nm de diámetro externo en cuyo interior se encuentra el genoma en forma de 10 segmentos de RNA de doble cadena. El genoma de los reovirus aviares expresa al menos 10 proteínas estructurales y 4 no estructurales. Estudios previos pusieron de manifiesto que la proteína no estructural ¿NS es la única proteína viral capaz de formar inclusiones globulares citoplasmáticas en células transfectadas, y que es capaz de reclutar a esas estructuras a la proteína no estructural ¿NS y a la proteína del core ¿A. Todo ello sugiere que ¿NS desempeña un papel importante en los primeros estadíos de la morfogénesis viral. El análisis de la secuencia aminoacídica de esta proteína reveló la existencia de dos regiones con alta probabilidad de formar estructuras coiled-coil (presentes en proteínas oligoméricas) cerca de su extremo C-terminal. Durante esta etapa de tesis hemos analizado las propiedades de las factorías virales que forma el reovirus aviar y de las inclusiones que forma la proteína µNS. Para ello hemos estudiado la distribución intracelular de las inclusiones tanto en células transfectadas con ¿NS como en células infectadas con el reovirus aviar, y hemos encontrado que las inclusiones citoplásmaticas que forma µNS no son agresomas, no están asociadas al citoesqueleto y no usan los microtúbulos celulares para su formación y maduración. Por otra parte, hemos demostrado la naturaleza homo-oligómerica de la proteína ¿NS mediante ensayos de doble híbrido, lo que puso de manifiesto que los monómeros de ¿NS interaccionan entre ellos. Además, la purificación de las inclusiones generadas por la expresión de muNS mediante un baculovirus recombinante en células de insecto, puso de manifiesto que esas inclusiones están desprovistas de proteínas celulares. Para tratar de identificar la región mínima de ¿NS que mantiene la capacidad para formar inclusiones hemos realizado delecciones de la proteína a partir de los extremos amino y carboxilo. El análisis de la capacidad de las versiones truncadas de ¿NS para formar inclusiones citoplasmáticas, mediante microscopía de fluorescencia, reveló que la región mínima de µNS con capacidad para formar inclusiones comprende los residuos 448-635 y contiene 4 dominios bien diferenciados: dos regiones Coiled-coil, Coil1 y Coil 2, una región Intercoil que los une, y una región C-terminal que sigue al segundo Coil. Posteriormente se estudió el papel que juegan los diferentes dominios en la formación de inclusiones y llegamos a las siguientes conclusiones: i) El Coil 1 y la región C-terminal son necesarios para formar inclusiones, aunque pueden ser sustituidos por un dominio de dimerización, lo que sugiere que participan en la interacción entre monómeros para formar oligómeros basales. ii) Mutaciones individuales de la His-487 y de la Cys-489, presentes en la región Intercoil, anulan la capacidad de formar inclusiones, indicando que estos residuos son imprescindibles para formar inclusiones. iii) El dominio C-terminal juega un papel clave en la orientación de los monómeros de ¿NS para formar oligómeros basales, controlando así la forma de las inclusiones y la eficiencia de su formación. También hemos identificado diferentes dominios de µNS que son capaces de incorporarse a las inclusiones citoplasmáticas formadas por la proteína entera. Para ello diferentes regiones de ¿NS fusionadas a GFP o al epitopo HA se co-transfectaron con µNS y se analizó su distribución intracelular por microscopía de fluorescencia. De esta manera identificamos dominios de ¿NS implicados en la interacción entre monómeros de ¿NS, de los cuales el dominio Intercoil es el que se incorpora con mejor eficiencia. A continuación, hemos utilizado el dominio Intercoil para etiquetar proteínas exógenas y dirigirlas a las inclusiones, lo que nos permitió desarrollar un sistema para detectar asociaciones entre proteínas in vivo, tanto en el citoplasma como en el núcleo de células eucariotas. Además, aprovechando esa misma característica hemos desarrollado un método para purificar proteínas asociadas a las inclusiones en células de insecto. Con estos últimos resultados, se ha presentado una solicitud de patente basado en esta proteína para la purificación de proteínas y para la detección de asociaciones entre proteínas in vivo.