Determinación de elementos minoritarios, traza y ultratraza en biopsias procedentes de pacientes con diferentes patologías tumorales mediante ETAAS, ICP-OES e ICP-MS utilizando extracción asistida por ultrasonidos y multigestión de bajo volumen

Resumo

El objetivo principal de esta tesis doctoral es la determinación de metales minoritarios, traza y ultratraza en tejidos tumorales humanos mediante el desarrollo de metodologías analíticas adecuadas y robustas que permitan obtener resultados precisos y exactos, de manera que puedan ser aplicadas al análisis de rutina. En este sentido, se ha buscado la solución óptima a cada uno de los problemas planteados. Para llevar a cabo este objetivo se han evaluado la extracción ácida asistida por ultrasonidos con ETAAS para la determinación de selenio y la digestión múltiple de bajo volumen con ICP-OES e ICP-MS para llevar a cabo determinaciones multielementales. Los objetivos específicos de este trabajo son los siguientes: 1) Establecer y describir un protocolo para coordinar el trabajo del equipo médico de cirujanos , el equipo médico de anatomía patológica y el laboratorio de análisis de químico instrumental que permita una buena trazabilidad de la muestra en cuanto a su caracterización así como definir las pautas a seguir en cuanto a su posterior conservación y pretratamiento. 2) Determinación de selenio en biopsias de mama mediante la puesta a punto de una metodología que utilice UAE y ETAAS. Dada la importancia toxicológica y clínica de este elemento, nos propusimos desarrollar la puesta a punto de una metodología analítica lo suficientemente sensible y exacta para la cuantificación y estudio de este elemento en muestras de tejidos humanos relacionadas con el cáncer de mama y aplicable al análisis de rutina. En este sentido, la extracción asistida por ultrasonidos en combinación con Zeeman-ETAAS es una propuesta simple, fácilmente adaptable a la rutina clínica y a pequeñas cantidades de muestra como las biopsias humanas. 3) Desarrollo de la digestión múltiple de bajo volumen para la determinación multielemental de elementos traza y ultratraza en biopsias mediante ICP-MS. Tal y como se ha comentado en la introducción, para el diagnóstico y control de enfermedades genéticas, deficiencias nutricionales y exposiciones medioambientales u ocupacionales puede ser necesario determinar de forma rutinaria diferentes elementos en tejidos (biopsias). El número de estos elementos de interés ha aumentado enormemente en la última década, por lo que a la necesidad de determinar un número elevado de elementos a nivel traza y ultratraza, se suma la dificultad del tamaño de la muestra disponible. En general, la determinación de elementos traza mediante ICP-MS en muestras clínicas suele llevarse a cabo tras la disolución de la muestra mediante digestión ácida asistida por microondas. Ello supone una fuerte dilución, por lo que para ciertos elementos los límites de detección alcanzados no son adecuados. En este trabajo se desarrolla, sobre la base de la utilización de los hornos de microondas convencionales, un sistema de digestión que elimine este problema. Para ello se recurrirá a la utilización de pequeños viales de teflón cerrados dentro de los reactores convencionales del horno de microondas (digestión múltiple de bajo volumen). 4) Desarrollo de la digestión múltiple de bajo volumen para la determinación multielemental de elementos traza y ultratraza en biopsias mediante ICP-OES. Habitualmente, si los elementos a determinar se encuentran a nivel minoritario o traza, la determinación multielemental de los mismos se lleva a cabo utilizando una técnica mucho más extendida a nivel de rutina como es el ICP-OES. En este caso, la poca cantidad de muestra disponible así como la menor sensibilidad del ICP-MS aconsejan adaptar la digestión múltiple de bajo volumen a esta técnica. 5) Generación de la huella digital elemental de tejidos tumorales y no tumorales adyacentes de pacientes con cáncer colorrectal. En esta parte del trabajo se investigará la distribución elemental en muestras tumorales y no tumorales adyacentes procedentes de tejidos de colon. Para ello, se aplicarán las metodologías analíticas desarrolladas con anterioridad. El significado de la concentración de diferentes elementos en estos tejidos se establece mediante diferentes técnicas quimiométricas. Las principales conclusiones que se deducen del trabajo realizado en la presente Tesis Doctoral se pueden resumir como sigue: La combinación de la extracción asistida por ultrasonidos con la espectrometría de absorción atómica con atomización electrotérmica y corrección de fondo Zeeman nos ha permitido desarrollar un método de determinación de selenio en tejidos sensible, rápido y sencillo, de manera que puede adaptarse fácilmente a la rutina del laboratorio clínico. Esta metodología permite trabajar con micromuestras de una manera eficiente mediante la utilización de la energía de ultrasonidos. La extracción del analito se lleva a cabo en una copa de automuestreador utilizando un volumen pequeño de extractante. Cabe destacar la composición de éste (ácido nítrico yperóxido de hidrógeno muy diluidos) frente a los ácidos concentrados utilizados en digestiones. La adición de peróxido de hidrógeno al extractante fue clave para poder trabajar con los tejidos conservados en formaldehido, no así en el caso de las biopsias liofilizadas. La utilización de la multi-inyección, la corrección de fondo Zeeman y el paladio como modificador de matriz permite resolver los problemas de sensibilidad e interferencias encontrados. Por otro lado, el desarrollo de la multidigestión de bajo volumen ha permitido establecer metodologías robustas y perfectamente adaptables a la rutina clínica para llevar a cabo determinaciones multielementales en biopsias, tanto mediante ICP-MS como mediante ICP-OES. Este desarrollo, basado en la utilización de tres viales de teflón insertados en un reactor de digestión de microondas convencional, posibilita el análisis de pequeñas muestras (20-30 mg de masa) con gran productividad y con mínima dilución. Los estudios llevados a cabo sobre el volumen de ácido nítrico, la utilización de una etapa de predigestión, la potencia de microondas y el tiempo de digestión nos han permitido establecer la robustez del procedimiento desarrollado. De esta manera, se pueden digerir hasta 24 muestras de un modo simultáneo en un horno de microondas convencional dotado de un rotor con capacidad para 8 reactores de digestión. El uso simultáneo de varias estrategias para la corrección de interferencias, en especial en lo que respecta a las determinaciones llevadas a cabo con ICP-MS, permite la determinación de gran número de elementos en el digestado obtenido. La aplicación de estas metodologías analíticas desarrolladas así como el uso de diferentes herramientas estadísticas, tanto paramétricas como no paramétricas, sobre los resultados obtenidos nos han permitido establecer claras diferencias entre los contenidos de algunos elementos en tejidos tumorales, adyacentes y sanos. En el caso de la determinación de Se por UAE-Zeeman-ETAAS en biopsias de mama, se ha establecido que el contenido de este elemento en los tejidos tumorales es significativamente mayor que en los tejidos adyacentes normales. Igualmente se ha establecido mediante multidigestión de bajo volumen e ICP-MS una concentración significativa de Se, Zn, Mn y Cu en los tejidos tumorales de mama, lo cual se puede vincular al papel desarrollado por estos elementos en la defensa contra la progresión del cáncer. Asímismo, mediante multidigestión de bajo volumen e ICP-OES se ha podido establecer la acumulación significativa en los tejidos tumorales de mama de Al, Ca, Mg, K, Cu, Mn, P y Zn (todos los elementos estudiados excepto Fe y S). Es de destacar los casos del Ca y el Al, ya que estos dos elementos se acumulan en gran extensión en los tejidos tumorales de mama. El Ca se acumula en el tumor debido a la formación de microcalcificaciones, las cuales juegan un papel importante en la extensión de los tumores a los tejidos adyacentes. El caso del aluminio es muy interesante y necesita un estudio adicional debido a que se trata de un elemento considerado hasta el momento como no esencial. Estos mismos elementos fueron determinados aplicando la multidigestión de bajo volumen con ICP-MS e ICP-OES en biopsias de tejidos colorrectales. Las buenas características de estas metodologías junto con la cantidad de muestras analizadas (76 muestras de tejido tumoral y adyacente correspondientes a 38 pacientes) proporcionaron resultados muy consistentes en lo que respecta a los elementos y el cáncer colorrectal. Este estudio es uno de los casos clínicos sobre el tema más completos, dado el escaso número de muestras que habitualmente se utiliza en este tipo de estudios y la variabilidad de los tejidos (en este caso no se producen diferencias debidas a la genética, el medio ambiente o la dieta, debido a la utilización de muestras pareadas). Al igual que en las biopsias tumorales de mama, llama la atención la acumulación del Al en los tejidos tumorales de colon. La aplicación del análisis de componentes principales permitió establecer la diferente carga de los elementos en los tejidos tumorales y en los no tumorales. El análisis discriminante lineal permitió diferenciar entre tejidos tumorales y no tumorales utilizando las concentraciones elementales como un indicador del cáncer de colon y, en menor extensión, del estadio de la enfermedad.