Análisis de la expresión de la proteína cd26 en relación con otros marcadores de células madre tumorales y estudios funcionales en líneas celulares de cáncer de colon

Résumé

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más común en el mundo. Aproximadamente el 50% de los pacientes con cáncer colorrectal desarrollan metástasis, convirtiéndose así en uno de los cánceres más agresivos. La metástasis es un fenómeno complejo que se desarrolla en varias etapas, la intravasación de células cancerosas del tumor primario, difusión a través de la circulación y extravasación en diferentes órganos, supervivencia a la llegada, asentamiento en latencia y reactivación, división y colonización del órgano y generación de un nuevo tumor macroscópico. Además, se ha descubierto recientemente que las células que originan la metástasis provienen de las denominadas células madre tumorales (CSCs). La proteína CD26/DPPIV participa en el proceso tumoral ya que se ha demostrado que la expresión y/o la actividad de CD26 están alteradas en varios tipos de cánceres. CD26 es una glicoproteína transmembrana con actividad serina peptidasa que está implicada en el control de varios procesos celulares tales como diferenciación celular, modulación inmune, adhesión, migración, invasión y apoptosis. Mientras que algunos estudios demostraron que la expresión de CD26 se asocia positivamente con estadios tumorales malignos, presencia de metástasis a distancia y peor pronóstico, otros resultados, en contradicción demostraron la inexistencia de su asociación con parámetros clínico-patológicos. Asimismo, se sugirió que los niveles de sCD26 en el suero de los pacientes son un potencial marcador en diferentes tipos de cáncer. En el contexto del cáncer colorrectal, los niveles séricos de sCD26 fueron más bajos en pacientes que en donantes sanos. En otros estudios, los niveles más altos de sCD26 se encontraron en tumores colorrectales pertenecientes a estadios D de Dukes y estos altos niveles se propusieron como marcador para la detección temprana de la recurrencia de la enfermedad y metástasis. Entre los estudios funcionales que abordaron el papel de CD26 en el cáncer colorrectal recientemente se ha demostrado que la unión de adenosina a CD26 desencadena la regulación negativa de CD26, dando como resultado una disminución de la unión de células de cáncer colorrectal a fibronectina y de la migración celular. Recientemente, CD26 se identificó como un marcador de células madre tumorales (CSCs) en varios tipos de cáncer. En cáncer colorrectal, se ha descrito como un marcador de una subpoblación de CSCs que podría corresponder a las células madre metastásicas. En este contexto, se demostró que CD26 promueve el desarrollo de metástasis mediante la unión a componentes de la matriz extracelular que participan en la regulación de la expresión de marcadores de la transición epitelio-mesénquima (TEM). Por lo tanto, el objetivo principal de la presente tesis ha sido establecer un modelo in vitro para estudiar la expresión de CD26 en combinación con marcadores de las CSCs y de la TEM y así estudiar su relación con la inducción de capacidades funcionales pro-metastásicas como invasión, migración y agregación. Como punto de partida, se analizó la expresión de la proteína CD26 en un panel de líneas celulares derivadas de tumores en diferentes estadios de la enfermedad: SW1116 (estadio A), SW480 (estadio B), DLD-1 (estadio C), SW620 (estadio C), metástasis de ganglios linfáticos, HT-29, Caco-2, COLO205 (estadio D) y T84 (derivada de metástasis pulmonar). La expresión de la proteína se analizó por citometría de flujo, immunoblot e inmunofluorescencia. En los resultados obtenidos mediante immunoblot e inmunofluorescencia se detectó expresión de CD26 en las líneas celulares SW1116, HT-29, Caco-2, COLO205 y T84, pero no en las células SW480, SW620 y DLD-1. Los resultados obtenidos por citometría de flujo mostraron expresión de CD26 en todas las líneas celulares. Las líneas celulares SW1116, HT-29, Caco-2, COLO205 y T84 mostraron los niveles más altos de CD26. La línea celular DLD-1 mostró niveles intermedios de expresión de CD26, mientras que las líneas celulares SW480 y SW620 expresaron niveles muy bajos de CD26. La expresión de CD26 fue mayor en aquellas células con fenotipo epitelial que en aquellas con fenotipo mesenquimal. Según esto, la expresión de CD26 varía dependiendo del estadio de la enfermedad. Con respecto a la expresión de los otros marcadores de CSCs, todas las líneas celulares mostraron frecuencias muy altas de EpCAM y frecuencias bajas de LGR5. Las líneas celulares HT-29 y Caco-2 fueron las únicas que mostraron niveles de expresión muy altos de todos los marcadores de CSCs analizados excepto de LGR5. En las otras líneas celulares, la expresión de los marcadores CD133 y CD44 fue bastante heterogénea. Además de los marcadores de CSCs mencionados anteriormente, se analizó la auto-fluorescencia intrínseca celular y la auto-fluorescencia potenciada con riboflavina, ya que se ha descrito en la literatura como un nuevo marcador exclusivo de las células madre tumorales. Las frecuencias de esta población en las líneas fueron muy bajas. La línea HT-29 mostró el mayor porcentaje de células auto-fluorescentes antes y después del tratamiento con riboflavina, mientras que la línea SW620 presentó el porcentaje más bajo, que no se vio potenciado después del tratamiento con la vitamina. En cuanto a los marcadores de la transición epitelial-mesenquimal, las líneas celulares SW480 y SW620, que no expresaron E-cadherina, fueron las únicas que expresaron vimentina. También se realizaron ensayos de inmunofluorescencia para obtener información sobre la localización subcelular de los marcadores de CSC y de la TEM. La mayoría de los marcadores están relacionados con la adhesión célula-célula, directamente (como E-cadherina, CD44 o EpCAM) o indirectamente a través de la matriz extracelular. En nuestro panel de líneas celulares, todas presentaron subpoblaciones que expresan los marcadores de CSC analizados, pero con bastante heterogeneidad. El conocimiento actual de los tejidos normales y tumorales indica que las células madre se definen raramente por un único marcador, pero sí por una combinación de múltiples marcadores moleculares. Por lo tanto, hemos establecido todas las posibles combinaciones entre los marcadores y también hemos analizado todas las posibles combinaciones de subpoblaciones con alta intensidad de expresión de los marcadores. La mayoría de las líneas celulares presentaron la subpoblación CD26high.La combinación más destacada ha sido LGR5+/EpCAMhigh, ya que todas las líneas celulares han presentado esta subpoblación, lo que probablemente indica que estos marcadores son los que mejor identifican a las CSCs. La línea celular SW620 mostró las frecuencias más bajas de LGR5+/EpCAMhigh, lo que podría sugerir que esta línea tiene el menor número de CSCs y, por lo tanto, menor capacidad tumorigénica. Esto se confirma por el hecho de que esta línea presenta las frecuencias más bajas de los marcadores de las CSCs, CD26, LGR5 y CD44, E-cadherina y el porcentaje más bajo de células auto-fluorescentes. Con el objetivo de enriquecer la presencia de CSCs, analizamos si todas las líneas celulares eran capaces de formar cultivos en tres dimensiones, también llamados esferoides. Confirmamos la presencia de CSCs en todas las líneas, sin embargo se observaron diferencias en la estructura y el tamaño de los mismos. A continuación, se evaluó la capacidad de regeneración de los esferoides y se observó que todas las líneas celulares formaron al menos una generación. Dado que los marcadores de las CSCs deberían enriquecerse durante la formación de esferoides, se analizó la expresión de CD26 y los otros marcadores de CSCs y de la TEM en las células derivadas de ellos. Todas las células derivadas de los esferoides (esf) obtenidos de las ocho líneas celulares, excepto SW480esf, DLD-1esf y SW620esf, mostraron altas frecuencias de CD26. En los esferoides obtenidos de las líneas celulares que mostraron las frecuencias más bajas de CD26 (SW480 y SW620), el porcentaje de células CD26+ se incrementó. En relación con los marcadores de las CSCs, todos los esferoides mostraron frecuencias altas de EpCAM. DLD-1esf y T84esf mostraron niveles de expresión bajos de CD133, SW1116esf, SW480esf, SW620esf y HT-29esf presentaron niveles intermedios, y Caco-2esf y las COLO205esf mostraron niveles altos. Los esferoides derivados de las líneas celulares DLD-1, HT-29, Caco-2, COLO205 y T84 mostraron positividad alta de CD44. SW1116esf y SW480esf expresaron niveles intermedios, mientras que en el caso de esferoides obtenidos de la línea celular SW620, se observaron frecuencias bajas de CD44. Las células derivadas de los esferoides de la mayoría de las líneas celulares mostraron frecuencias altas de E-cadherina, mientras que las SW620esf mostraron frecuencias bajas. La mayoría de las células derivadas de los esferoides mostraron frecuencias intermedias/bajas de LGR5. LGR5 fue el marcador que experimentó el mayor incremento en las células derivadas de los esferoides en comparación con las líneas celulares originales. Siguiendo los mismos criterios que para las líneas celulares, analizamos todas las combinaciones posibles entre los marcadores y también analizamos todas las combinaciones posibles de subpoblaciones con expresión de marcadores de alta intensidad. Todas las células derivadas de esferoides excepto las SW480esf y SW620esf presentaron una subpoblación CD26high. Las frecuencias altas de CD26 presentadas por los esferoides obtenidos a partir de las líneas celulares fueron ligeramente superiores a las frecuencias detectadas en los cultivos monocapa, excepto en las Caco-2esf, donde se observó lo contrario. La combinación más distinguida, como en las líneas, ha sido LGR5+/EpCAMhigh, ya que todos los esferoides presentaron esta subpoblación. Esta subpoblación es probablemente la que mejor representa a las CSCs, que proliferan dando lugar a los esferoides. Por otro lado, debido a las controversias encontradas en el papel de la E-cadherina durante la progresión tumoral, decidimos estudiar esta proteína con mayor detalle y observamos que en las líneas celulares analizadas y en los esferoides derivados de ellas, las células E-cadherina- mostraron un tamaño pequeño y que las frecuencias de los diferentes marcadores de células madre tumorales fueron más altas en la población E-cadherina+ que en las células E-cadherina-. Dado que los hallazgos anteriores, que enfatizan que la población LGR5+/ EpCAMhigh es la que mejor identifica a las CSCs y debido al gran interés manifestado por la población E-cadherina+, se analizaron los marcadores CD26, CD44 y CD133 en las poblaciones LGR5+/EpCAMhigh/E-cadherinhigh y en las poblaciones LGR5+/EpCAMhigh/E-cadherinalow de los esferoides obtenidos a partir de la línea celular T84. Después de analizar los resultados, pudimos concluir que la subpoblación LGR5+/EpCAMhigh/E-cadherinhigh también es CD26high, lo que sugiere una nueva combinación y más completa de marcadores para identificar las células madre tumorales. Por último, debido a que nuestro interés se centra fundamentalmente en la proteína CD26, hemos profundizado en su estudio a través de ensayos funcionales in vitro (agregación, migración e invasión), que representan diferentes mecanismos que participan en el proceso metastásico, lo que nos ha ayudado a conocer mejor el papel que juega esta proteína durante la progresión tumoral. Para ello, en primer lugar evaluamos la actividad dipeptidil peptidasa IV de CD26 en las líneas celulares elegidas para los ensayos funcionales (SW1116, SW620, HT-29 y T84) y analizar el efecto de la inhibición de la actividad DPPIV usando el inhibidor sitagliptina. Los resultados mostraron que la línea celular SW1116 es la que tiene la actividad DPPIV más alta, seguida por HT-29, T84 y finalmente SW620. Los ensayos de agregación se realizaron para analizar el efecto de los niveles de CD26 y de la actividad enzimática de DPPIV sobre la capacidad de adhesión en las líneas celulares de cáncer de colon estudiadas. Los resultados mostraron que las líneas celulares que expresaban niveles altos de CD26 (SW1116, HT-29 y T84) fueron capaces de adherirse formando agregados mientras que la línea celular que expresaba niveles bajos de CD26 (SW620) no pudo formarlos. Estos resultados sugirieron que los niveles de expresión de CD26 podrían estar relacionados con la capacidad de adhesión de las líneas celulares de cáncer de colon. Posteriormente, para verificar si la agregación celular podría verse afectada por los niveles de expresión de CD26, se seleccionó una línea celular que expresara niveles altos de CD26, HT-29. Las células de la línea HT-29 se separaron en dos subpoblaciones, CD26high y CD26low. Una vez separadas, se analizó la capacidad de agregación en las diferentes subpoblaciones celulares y los resultados mostraron que las células CD26high fueron capaces de formar agregados compactos mientras que las células CD26low mostraron una menor capacidad para establecer contactos celulares, confirmando que la agregación está relacionada con los niveles de expresión de CD26. Finalmente, para comprobar si la capacidad de agregación también está relacionada con la actividad enzimática de DPPIV, los ensayos de agregación se repitieron añadiendo el inhibidor sitagliptina y los resultados mostraron que las líneas celulares SW1116, T84 y HT-29 bajo el efecto del inhibidor de sitagliptina a una concentración de 0,2 mM continuaron formando agregados con las mismas características descritas anteriormente, mientras que las células SW620 continuaron sin formarlos. Por lo tanto, bajo estas condiciones, la actividad de DPPIV no parece estar relacionada con la capacidad de agregación. Los resultados del ensayo de migración mostraron que las líneas celulares HT-29 y T84 tienen una mayor capacidad migratoria que la línea celular SW1116. Además, en presencia del inhibidor de la DPPIV, sitagliptina, todas las líneas celulares mostraron una disminución significativa en la migración. Para evaluar si la migración celular podría verse afectada por los niveles de expresión de CD26, se analizaron las poblaciones CD26high y CD26low de la línea HT-29 y se encontró que las células CD26high migraron más rápido que las células CD26low. En general, los resultados indican que la actividad de DPPIV y la expresión de CD26 están relacionadas con las propiedades migratorias de las líneas celulares de cáncer de colon. Finalmente, se evaluó la invasividad de las células tumorales y los resultados mostraron que las líneas celulares tumorales analizadas, en condiciones basales, no fueron invasivas. Aun así, evaluamos la invasividad bajo el efecto del inhibidor sitagliptina y observamos que cuando se inhibe la actividad de DPPIV, las células tienen una menor capacidad invasiva. Concluimos que el modelo in vitro sirve para confirmar la presencia de CD26 en una población importante de CSCs y por tanto para poder estudiar su función en ellas así como si puede ser una diana terapéutica en la metástasis de CCR y otros cánceres.