Identificación de la octopina deshidrogenasa (ocdh) de mytilus galloprovincialis lmk. (molluscabivalvia). Implicaciones evolutivas

Resumo

Se han clonado tres secuencias de cDNA que codifican deshidrogenasas de opinas (OpDH) putativas en Mytilus galloprovincialis. Estas secuencias se distinguen claramente unas de otras demostrando que en los tejidos de este mejillón existen diferentes transcritos de esta familia de proteínas. Al alinear y comparar las secuencias de aminoácidos deducidas, obtenidas en M. galloprovincialis, con las secuencias disponibles en las bases de datos genéticas se observa un alto grado de similitud con las enzimas OpDH de otros invertebrados marinos con las que, además, comparten algunos motivos estructurales de unión a substrato. Estos datos sugieren que las secuencias clonadas en M. galloprovincialis pertenecen a diferentes enzimas de la familia de las OpDH. Utilizando las secuencias obtenidas en M. galloprovincialis, junto con otras secuencias disponibles en las bases de datos, se diseñaron diferentes cebadores que permitieron amplificar, clonar y secuenciar el cDNA que codifica la Octopina deshidrogenasa (OcDH) de M. galloprovincialis. La región codificante completa se expresó en la bacteria Escherichia coli y la proteína recombinante resultante fue purificada. La OcDH de M. galloprovincialis muestra una mayor afinidad por la Larginina como substrato aminoacídico, que por la L-alanina o por la glicina, mientras que no muestra actividad enzimática al utilizar la taurina o la !-alanina como substratos. Estos datos apoyan la suposición de que la enzima recombinante sea la OcDH y no otra deshidrogenasa de opinas como la alanopina deshidrogenasa o la estrombina deshidrogenasa. La superposición del modelo tridimensional teórico de la OcDH de M. galloprovincialis y de la estructura cristalizada de su homóloga en la vieira gigante Pecten maximus, muestra cambios en los sitios de unión al aminoácido que podrían explicar las diferencias encontradas entre las proteínas de ambos moluscos con respecto a su 24 afinidad de substrato. La octopina deshidrogenasa se ha identificado por primera vez en la familia Mytilidae, y es el segundo caso de OcDH identificada dentro de los invertebrados marinos. El locus enzimático OcDH ha sido tradicionalmente utilizado en el género Mytilus como un gen parcialmente diagnóstico de M. galloprovincialis con respecto a los otros dos taxones (M. edulis y M. trossulus) del complejo de especies Mytilus edulis. Se ha estudiado la variabilidad y la filogenia de este gen en muestras de mejillones recogidas en diferentes lugares del mundo con el objetivo de intentar clarificar las relaciones evolutivas entre los distintos taxones de Mytilus. Tal y como se había postulado con anterioridad el taxón M. trossulus parece haber divergido antes de la separación entre M. galloprovincialis y M. edulis. Por otro lado, M. edulis sería un grupo más homogéneo, mientras que M. galloprovincialis se presentaría como un grupo cosmopolita y muy heterogéneo. Se llevaron a cabo análisis filogenéticos para comparar las OpDH de M. galloprovincialis con otras secuencias anotadas de las cinco enzimas de la familia OpDH presentes en 19 especies de invertebrados marinos, distribuidos en siete clases taxonómicas y 5 phyla. El árbol obtenido agrupa a las enzimas OpDH de acuerdo con las relaciones evolutivas de las especies y no atendiendo a la reacción bioquímica catalizada. En resumen, se clonaron tres secuencias parciales de diferentes OpDH y la secuencia completa de la OcDH del mejillón M. galloprovincialis. Esta última se caracterizó parcialmente y se identificó tras expresión heteróloga. Se analizó la variabilidad y la filogenia de las secuencias del gen de la OcDH en poblaciones de Mytilus distribuidas a lo largo del mundo, y se intentaron determinar las relaciones evolutivas de las enzimas de la familia OpDH en diferentes especies de invertebrados marinos.