Caracterización molecular del gen E de la familia glicoproteina-p de leishmania trópica

Abstract

El objetivo de la presente tesis doctoral ha sido la caracterizacion molecular del gen ltrpgpe sobrexpresado en la linea de leishmania tropica resistente a 1 mm de metotrexato. El aislamiento del gen se realizo mediante rastreo de una genoteca del parasito resitente a metrotexato, usando una sonda especifica para el gen ltpgpe de l. Tarentolae. Se aislo un clon en el que se encontro un marco abierto de lectura que codificaba para una proteina de 1677 aminoacidos, con un peso molecular estimado de 186 kda. Se encontro que el gen ltrpgpe mantenia homologia significativa con miembros de la superfamilia abc y que la maxima homologia era mantenida con glicoproteinas-p de l. Tarentoale no relacionadas con fenotipo mdr. El gen fue localizado en un cromosoma de 1500 kb, organizado como un gen de copia unica, detectando un polmorfismo en el locus que contiene al gen lrpgpe. El estudio de la funcionalidad del gen ltrpgpe fue llevado a cabo sobre los parasitos transfectados con el gen ltrpgpe y fue enfocado en primer lugar hacia un estudio del posible papel de la proteina en resistencia a farmacos. Para ello se determinaron los indices de resistencia frente a una amplia variedad de compuestos. Los resultados obtenidos mostraron que bajo las condiciones experimentales usadas el gen ltrpgpe confiere bajos niveles de resistencia a derivados de arsenico. En segundo lugar quisimos saber si el gen se encuentra modificando el ph citoplasmtico, papel que ha sido atribuido a otras glicoproteinas-p. Se realizaron medidas de ph intracelular tanto en parasitos silvestres como trasfectados con el gen encontrando que el ph intracelular de leishmania tropica no se veia afectado por la sobreexpresion del gen itrpgpe. Por ultimo se determino en los parasitos transfectados con el gen ltrpgpe el posible papel regulador atribuido a las glicoproteinas-p sobre la actividad de canales anionicos activados por choque hipotonico. Para ello se estudio la activida