Stress effects on brain circadian system and monoaminergic activity in rainbow trout. Mechanisms and consequences on food intake regulation

Resum

Una gran parte de la población mundial depende del pescado como principal fuente de proteína animal tomada en la dieta. Sin embargo, la industria pesquera es incapaz de proveer dicha creciente demanda, al encontrarse los caladeros al límite de su explotación. Por este motivo se han tenido que desarrollar nuevas estrategias que puedan garantizar el suministro de pescado, fundamentalmente ligadas al desarrollo de la acuicultura (FAO, 2014). No obstante, la acuicultura es un proceso costoso, sobre todo debido a las exigencias de la alimentación, por lo que es prioritario desarrollar estrategias que la hagan más eficiente con objeto de minimizar el coste económico y medioambiental (asociado al alimento no ingerido). Por ello es necesario conocer los mecanismos que modulan la ingesta, sabiendo que ésta es un proceso complejo que resulta de la integración a nivel central de diferentes factores tales como el propio comportamiento alimentario de la especie (Guillot et al., 2016; Stengel et al., 2011), la capacidad de los peces para detectar los niveles circulantes de nutrientes y su estatus energético (Conde-Sieira y Soengas, 2017), así como la capacidad de generar respuestas predictivas de un modo rítmico (ver Hardin y Panda, 2013). Distintos factores externos e internos, tales como el estrés, pueden afectarla. En este último caso, resulta prioritario garantizar el bienestar de los animales, dado que si esto no ocurre, la eficacia del proceso de alimentación se ve negativamente afectada, tal y como ocurre en una situación de estrés. Por tanto, conocer perfectamente los mecanismos implicados en el control de la ingesta de alimento en los peces es importante, dado que puede contribuir a la mejora en su bienestar y en su tasa de crecimiento. A nivel fisiológico, la regulación del comportamiento alimentario en los peces depende de diversos mecanismos integradores (metabólicos, circadianos, nerviosos y endocrinos) que actúan tanto a nivel central como periférico, los cuales a su vez están sujetos a la influencia de los procedimientos que a diario acontecen en una explotación acuícola. El hipotálamo es la región cerebral que desempeña el papel clave en la regulación de la ingesta de alimento, dado que en él se lleva a cabo la integración de numerosas señales internas y externas, elaborándose una respuesta generalmente mediada por la liberación de factores orexigénicos y/o anorexigénicos que determinan, respectivamente, el apetito y la saciedad. Por otro lado, el alimento (disponibilidad, hora a la que se lleva a cabo,…) desempeña un importante papel como señal sincronizadora del sistema circadiano, responsable de la mayoría de las funciones rítmicas del organismo. En este sentido, nuestros estudios previos llevados a cabo con la trucha arco iris pusieron de manifiesto la existencia de un oscilador circadiano en tejidos periféricos tales como el hígado, así como el papel del alimento como señal sincronizadora de la fisiología rítmica hepática (Hernández-Pérez et al., 2017), pero también en tejidos centrales como el hipotálamo (López-Patiño et al., 2011), región en la que se regula la ingesta de alimento. En este último caso, la existencia de un oscilador circadiano hipotalámico ha llevado a postular la existencia de relaciones recíprocas entre el sistema circadiano y sistema de control de la ingesta, de modo que los ritmos diarios de los factores moduladores de la ingesta de alimento estarían subordinados a la actividad del oscilador circadiano. Por otro lado, el estrés puede afectar negativamente al organismo, de modo que numerosas funciones fisiológicas y comportamentales que presentan un perfil rítmico diario pueden verse seriamente comprometidas. Dicho efecto negativo ha sido corroborado en tejidos periféricos de la trucha arco iris, como es el caso del hígado, en donde se apreció un aumento de la movilización de glucógeno que conduce a una mayor disponibilidad endógena de glucosa, un descenso de su uso en este órgano y en general en el potencial lipogénico hepático (Hernández-Pérez, 2016), así como alteraciones generales en la ritmicidad metabólica en este órgano. Estos resultados llevaron a especular con la existencia de efectos adversos del estrés en áreas cerebrales clave en el control del comportamiento alimentario y la fisiología rítmica diaria, como es el caso del hipotálamo. Teniendo en consideración que el estrés condiciona el bienestar animal y que bajo esta circunstancia se alteran numerosas funciones conductuales y fisiológicas del individuo, nuestro trabajo se centró, en primer lugar, en identificar dichas alteraciones a nivel del sistema circadiano hipotalámico de la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), así como en el control de la ingesta y los posibles mediadores de dichos efectos. Para ello, se evaluó el perfil diario de abundancia de mRNA hipotalámico de genes del reloj circadiano (clock1a, bmal1, per1 y rev-erbβ-like) y reguladores de la ingesta de alimento (crf, pomc-a1, cart y npy) en dicho teleósteo, el impacto del estrés en dichos ritmos y la participación de cortisol y sirtuina1(SIRT1) como posibles mediadores. Nuestros resultados revelaron el efecto del estrés en la mayoría de los genes analizados, si bien diferentes mecanismos parecen estar implicados. Los ritmos diarios de expresión de los genes reloj disminuyeron su amplitud y sus valores medios en los peces estresados, si bien no se observaron cambios significativos en las acrofases. Este efecto no fue prevenido por la mifepristona, un antagonista de los receptores de glucocorticoides (GR). Por el contrario, el efecto del estrés sobre el perfil diario de crf, pomc-a1 y npy fue totalmente contrarrestado por la administración del antagonista. En consecuencia, el cortisol parece mediar principalmente el efecto del estrés sobre los reguladores de la ingesta de alimentos en el hipotálamo través de la unión al receptor GR1. El estudio también aportó datos que hacían sospechar que SIRT1, un mediador ligado al estado redox y la respuesta de estrés a nivel celular, podría mediar los efectos sobre el sistema circadiano en esta misma región cerebral, hipótesis que debía ser evaluada. Para corroborar el papel mediador de SIRT1 en el efecto del estrés sobre el sistema circadiano hipotalámico de la trucha, se llevó a cabo un nuevo experimento con cuatro grupos de truchas controles y estresadas (72 h en elevada densidad) y tratadas o no con un inhibidor de la SIRT1 (EX527). Junto con la abundancia de mRNA de los genes mencionados anteriormente relativos al sistema circadiano y el control de la ingesta, también se evaluaron las variaciones dia-noche en la abundancia de las enzimas de la biosíntesis de cortisol (3β-hsd, 11β-h, p450scc y star) en el riñón anterior, así como en la de los GR en ambos tejidos (hipotálamo y riñón anterior), con objeto de evaluar la participación de la SIRT1 en la respuesta endocrina de estrés y la interacción entre SIRT1 y cortisol como potenciales señales mediadoras. Nuestros resultados concuerdan con la hipótesis de un papel clave desempeñado por SIRT1 como mediador del efecto del estrés sobre las variaciones diarias en la abundancia de ARNm de los genes del reloj hipotalámico en la trucha arco iris, así como en los péptidos relacionados con la ingesta de alimento en el mismo tejido. El estrés por alta densidad de stock inhibe la expresión de genes de reloj, mientras que la de los péptidos relacionados con la ingesta de alimento aumenta. El tratamiento con EX527 previene los cambios observados en los genes reloj durante la exposición al estrés, lo que evidencia el papel clave desempeñado por SIRT1 como mediador del efecto negativo del estrés sobre el sistema circadiano hipotalámico de esta especie. Por otro lado, los cambios de los péptidos relacionados con la ingesta de alimento durante el estrés se contrarrestaron parcialmente con el tratamiento con EX527. Este resultado es indicativo de la existencia de interacciones entre SIRT1 y otros mediadores (cortisol) durante la respuesta al estrés. En apoyo de esta idea, nuestros resultados muestran que SIRT1 influye en la biosíntesis del cortisol a nivel del riñón anterior durante la exposición a una situación de estrés. No obstante, es necesario realizar nuevos experimentos con objeto de identificar los mecanismos a través de los cuales SIRT1 participa en la respuesta del sistema circadiano y los péptidos reguladores de la ingesta de alimento al estrés, aun como la naturaleza de la interacción entre SIRT1 y otros mediadores. Algunos estudios llevados a cabo en diferentes especies de vertebrados sugieren que el sistema circadiano interactúa con otros sistemas moduladores, tales como los sistemas monoaminérgicos cerebrales y ciertos factores moduladores de la ingesta, entre otros. Respecto a los sistemas monoaminérgicos cerebrales, estudios en mamíferos señalan que éstos parecen participar en dicha interacción, en base a que poblaciones de células hipotalámicas que albergan un oscilador circadiano reciben señales procedentes de células monoaminérgias, a la vez que generan señales efectoras dirigidas a estas últimas. El resultado es una acción compleja que permite modular la coordinación de las numerosas funciones internas con los cambios que se producen en el ambiente externo del animal. En este sentido, se ha descrito la existencia de un nexo de unión entre los sistemas serotoninérgico y el sistema circadiano en mamíferos (Kripke, 1998; Loving et al., 2002; Benedetti et al., 2003). Además, también han sido descrita la existencia de ritmos diarios en las rutas de señalización dopaminérgica (Castañeda et al., 2004; Hood et al., 2010; Imbesi et al., 2009), los cuales son dirigidos tanto por la luz como el propio sistema circadiano (Hampp et al., 2008; Sleipness et al., 2007). También se ha visto la acción moduladora ejercida por la DA sobre la expresión de genes reloj in vivo e in vitro (Gravotta et al., 2011; Imbesi et al., 2009; McClung et al., 2005), lo que corrobora el papel de los sistemas monoaminérgicos como vía de entrada al sistema circadiano. No obstante, la información disponible a este respecto en otros grupos de vertebrados como es el caso de los peces, o bien no existe o es muy escasa. Con respecto a los factores moduladores de la ingesta, se sabe que el alimento desempeña un papel importante en la sincronización de las diferentes funciones rítmicas en vertebrados, incluidos los peces, dado su papel como vía de entrada de información a los osciladores circadianos, independientemente de dónde se encuentren estos (Delgado et al., 2017). Teniendo en cuenta la presencia del oscilador central en la misma región que alberga los centros moduladores de la ingesta de alimento en los peces, el hipotálamo, existe la posibilidad de que dicho oscilador pueda controlar la síntesis y liberación de los factores moduladores de la ingesta, utilizándolos como vías de salida de información al resto del organismo en este grupo de vertebrados. Conocida la naturaleza rítmica diaria encontrada para ciertos péptidos moduladores de la ingesta en la trucha arco iris, tal y como se ha mencionado anteriormente, la subordinación de dichos ritmos a la actividad del oscilador circadiano hipotalámico de la trucha debe ser confirmada. Con objeto de corroborar en los peces el papel desempeñado por los sistemas monoaminérgicos cerebrales y los factores moduladores de la ingesta, tanto actuando como vías de entrada de información al sistema circadiano, como vías señalizadoras de salida del mismo, al cual se subordinan, se diseñó un experimento con truchas arco iris, las cuales fueron adaptados a condiciones normales de alojamiento, o expuestas a 48 horas de oscuridad constante (DD), o bien expuestas a DD y ayunadas (DD+Fasting). Posteriormente fueron sacrificadas a lo largo de un ciclo de 24 horas, tomándose muestras de diferentes tejidos cerebrales (telencéfalo, hipotálamo, techo óptico y médula). Los resultados obtenidos confirman la existencia de ritmos diarios de abundancia del ARNm de las enzimas limitantes de la síntesis de 5HT (tph1 and tph2) y DA (th) en todas las regiones cerebrales analizadas, si bien dichos ritmos no se vieron reflejados claramente en el contenido de monoaminas en ninguna de las regiones analizadas. Los ritmos de expresión observados se conservaron en ausencia de señales encarriladoras externas, tales como la luz y el alimento. Por otro lado, la expresión de péptidos moduladores de la ingesta (crf, pomc-a1, cart y npy) también fue rítmica y se mantuvo en condiciones de ambiente constante. En consecuencia, en la trucha arco iris como modelo de peces, el oscilador central presente en el cerebro (concretamente el hipotálamo), parece generar los ritmos de monoaminas y péptidos moduladores de la ingesta, lo que sugiere una interacción entre dichos sistemas, de modo que tanto las monoaminas como los péptidos moduladores de la ingesta podrían participar como salidas del oscilador central hipotalámico. En cambio, el papel de las monoaminas y de los moduladores de la ingesta como vías de entrada a dicho oscilador todavía debe ser evaluado en este grupo de vertebrados. Finalmente, se sabe que los sistemas monoaminérgicos cerebrales ejercen su acción moduladora sobre un amplio rango de funciones entre las que se incluye el comportamiento alimentario (Leibowitz, 1992) así como durante la respuesta fisiológica al estrés en vertebrados (Dunn, 1988), incluidos los peces (Gesto et al., 2013). En este último caso, concretamente en la trucha arco iris, se ha especulado con la posibilidad de que los sistemas monoaminérgicos desempeñen un el papel crítico durante el inicio de la respuesta al estrés, así como durante el tiempo en el que el animal permanece en dicha situación (Gesto et al., 2015). Se sabe que la respuesta fisiológica al estrés conlleva la activación de los ejes cerebro-sistema simpático tejido cromafín e hipotálamo hipófisis tejido interrenal que conduce al aumento de las concentraciones plasmáticas de catecolaminas y cortisol, así como de la actividad monoaminérgica cerebral. Mientras que el aumento de las catecolaminas es de corta duración, los niveles de cortisol en sangre continúan elevados cierto tiempo (Barton, 2002). Además, cuando la situación de estrés se mantiene en el tiempo, es decir, se convierte en crónico, la respuesta del cortisol puede desvanecerse, lo que añade aún mayor complejidad a los mecanismos implicados en su regulación. En este sentido, los conocimientos relativos al papel de los neurotransmisores monoaminérgicos cerebrales durante el estrés crónico son bastante escasos, e incluso no se han desarrollado estudios centrados en la fase de post-stress, cuando cesan los estímulos estresantes y se recuperan los valores circulantes normales de cortisol. Con objeto de abordar la dinámica de los cambios ocasionados por la exposición a estrés, y una vez que desaparece el agente estresante, un grupo de truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) fue sometido durante 10 días a estrés por alta densidad, mientras que otros grupos se sometieron a la misma situación de estrés durante 7 días y posteriormente se devolvieron a densidad normal. Los animales de estos últimos grupos fueron sacrificados a las 2 h, 6 h, 24 h y 72 h tras el cese del estrés. Se tomaron muestras de sangre (para evaluar niveles de cortisol y metabolitos), de regiones cerebrales (para evaluar los niveles de monoaminas y la abundancia de thp1, thp2 y th, así como de neuropéptidos moduladores de la ingesta: crf, pomc-a1, cart y npy) y del riñón anterior (expresión de star, 3β-hsd, p450ssc y 11β-h). Los resultados mostraron que los peces estresados sufrieron un aumento en los niveles de cortisol en plasma, así como en las actividades dopaminérgica y serotoninérgica, especialmente en telencéfalo e hipotálamo y en menor medida en techo óptico y cerebro posterior. También se observó una mayor abundancia de ARNm de star, 3β hsd, p450ssc y 11β-h en el riñón anterior, y de tph1, tph2 y th en el cerebro en general. Las actividades monoaminérgicas disminuyeron a valores basales a las 2-6 horas de cesar la situación de estrés, algo similar a lo que ocurrió con el cortisol plasmático. El estrés también causó un aumento de la expresión de crf, pomc-a1 y cart en el hipotálamo, el cual desapareció rápidamente tras el cese del estrés. En cambio, no se apreciaron cambios significativos en los niveles de npy en los peces estresados, si bien dicho péptido aumentó significativamente tras el retorno de los animales a una situación normal (no estrés). Estos resultados revelan que, a diferencia de los péptidos anorexigénicos (crf, pomc-a1, cart) el npy no parece tener un papel clave en la reducción de la ingesta de la trucha arco iris durante el estrés crónico, pero en cambio su aumento durante la recuperación del estrés ayuda al animal a compensar más rápidamente el estatus nutricional previo a la exposición de estrés. Por tanto, la respuesta fisiológica que se pone en marcha por el estrés crónico en la trucha arco iris parece disiparse en un periodo de tiempo relativamente corto (2-6 h) cuando cesa el estrés. La dinámica temporal de los cambios que ocurren en las monoaminas cerebrales, especialmente en las regiones diencefálicas y telencefálicas, tiene un gran paralelismo como los que ocurren en el eje de estrés y en los neuropéptidos hipotalámicos que actúan de forma anorexigénica. Por otro lado, el estrés crónico aumentó la expresión de receptores gr1, sin producir cambios en los gr2. Tras el cese del estrés se produjo una recuperación de los niveles basales de expresión de gr1 que, en el caso del hipotálamo y telencéfalo, mostró un gran paralelismo temporal con los cambios encontrados en los sistemas monoaminérgicos. Estos datos sirven de apoyo al papel que ejercen las monoaminas cerebrales en el inicio de la respuesta fisiológica al estrés, la cual parece ser operativa en el reconocimiento de la situación estresante y en mantener la activación neuroendocrina a lo largo del tiempo, pero también en la modulación de su desactivación cuando el pez regresa a una situación de ausencia de estrés. En resumen, los resultados obtenidos durante la realización de la presente Tesis Doctoral han permitido caracterizar en el hipotálamo de la trucha arco iris los ritmos diarios de abundancia de mRNA de genes del oscilador circadiano (clock1a, bmal1, per1 y rev-erbβ-like), así como de péptidos reguladores de la ingesta de alimento (crf, pomc-a1, cart y npy), la interacción entre ambos sistemas, así como el efecto negativo que el estrés ocasiona en su funcionamiento, bien a través de la acción mediadora del cortisol (fundamentalmente sobre el control de la ingesta), o de la SIRT1 (mayoritariamente sobre el oscilador circadiano), si bien no se descarta la existencia de interacciones entre ambos mediadores. Además, se han caracterizado los ritmos diarios de parámetros relacionados con las actividades monoaminérgicas cerebrales, básicamente las enzimas limitantes de la síntesis de 5HT (tph1 y tph2) y DA (th) y su dependencia del oscilador circadiano, el cual los genera. Finalmente, se ha podido demostrar en la trucha arco iris el papel clave desempeñado por dichos sistemas monoaminérgicos durante la respuesta fisiológica al estrés, así como durante la recuperación del animal una vez el estrés cesa.