Modulación de los canales de potasio K2P por proteínas G y vías de segundos mensajeros en neuronas simpáticas de ratón en cultivo

Resumo

Las neuronas son células excitables que responden a estímulos con cambios en el potencial de membrana en reposo. La generación y mantenimiento del potencial de membrana en reposo se explica como una conductancia constante llamada corriente de fuga compuesta principalmente por K+ y con una contribución menor de Cl- y Na+. Los canales K2P o de doble dominio de poro son canales de potasio de reciente descubrimiento implicados en el mantenimiento de este potencial de membrana. Esta familia de canales está compuesta por 6 subfamilias llamadas TREK, TASK, TRESK, TALK, TWIK y THIK. Los canales K2P se distinguen del resto de canales de potasio tanto por su estructura como por la insensibilidad a bloqueantes clásicos. Además, responden a ciertos fármacos utilizados para la esclerosis lateral amiotrófica, depresión, epilepsia, etc., por lo que se cree que están implicados en diversas patologías. Los canales K2P también se modulan a través de proteínas G que activan cascadas de segundos mensajeros. La activación de la proteína G?q provoca la activación de la enzima PLC que hidroliza PIP2 en IP3 y DAG. Estos promueven el aumento del Ca+2 intracelular y la activación de proteinquinasas. Se ha visto que algunos de estos segundos mensajeros podrían estar implicados en la modulación de corriente a través de los canales K2P. En el caso de las proteínas G?s y G?i el mecanismo de actuación depende de los niveles de AMPC. La activación de G?s aumenta la cantidad de AMPc, mientras que G?i actúa de manera opuesta modulando la corriente a través de los canales. La mayor parte de los estudios sobre esta modulación se han realizado sobre sistemas heterólogos, mientras que son muy pocos los realizados en sistemas autólogos. En el presente proyecto se pretende estudiar la modulación de los canales de la subfamilia TREK a través de proteínas G y su efecto sobre el potencial de membrana en reposo y la excitabilidad neuronal en neuronas de ganglio cervical superior de ratón en cultivo primario. Para realizar este proyecto se utilizarán técnicas electrofisiológicas de “patch-clamp” en su modalidad de sello perforado y registro en canal individual. Los registros se realizarán en neuronas del ganglio cervical superior de ratón en cultivo. Las neuronas del ganglio cervical superior se obtienen de ratones de 20 a 60 días de los cuales se extraen los ganglios que tras ser lavados y tratados con enzimas se disgregan mecánicamente para individualizar las células. Las neuronas se siembran en pocillos y se incuban durante 24-48 horas a 37ºC y 5 % de CO2. Transcurrido este tiempo se realiza el registro electrofisiológico utilizando un microscopio invertido y un sistema de perfusión constante donde se aplican las soluciones de baño y las drogas. El registro se realizará utilizando las técnicas de “patch-clamp” en la modalidad de “Whole-cell” en su variante de sello perforado y en el modo “Single-Channel” en la configuración de “cell-attached”. Los registros se realizarán con un amplificador de “patch” y los datos se almacenarán en un ordenador compatible a través de una tarjeta convertidora utilizando el programa Clampex. Se realizarán experimentos de fijación de voltaje para caracterizar las corrientes iónicas de reposo y experimentos de fijación de corriente para estudiar las variaciones del potencial de membrana tras la aplicación de distintos fármacos. Los registros serán analizados y representados utilizando los programas Clampfit y Origin. Concretamente los experimentos consisten en registrar la corriente activada por Riluzole a través de los canales TREK cuando se le aplica en primer lugar el agonista del receptor muscarínico Oxotremorina-M. En presencia de este agonista se probarán moduladores selectivos del receptor muscarínico y de los distintos componentes de la cascada de segundos mensajeros con el fin de determinar qué componentes y cómo están implicados en la regulación de la corriente a través de los canales K2P.As neuronas son células excitables que responden a estímulos con cambios no potencial de membrana en repouso. A xeración e o mantemento do potencial de membrana en repouso explícase coma unha condutancia constante chamada corrente de fuga composta principalmente por K+ e cunha contribución menor de Cl- e Na+. Os canais K2P ou de dobre dominio de poro son canais de potasio de recente descubrimento implicados no mantemento deste potencial de membrana. Esta familia de canais está composta por 6 subfamilias chamadas TREK, TASK, TRESK, TALK, TWIK y THIK. Os canais K2P distínguense do resto de canais de potasio tanto pola súa estrutura como pola insensibilidade a bloqueantes clásicos. Ademais, responden a certos fármacos utilizados para a esclerose lateral amiotrófica, depresión, epilepsia, etc., polo que se cree que están implicados en diversas patoloxías. Os canais K2P tamén se modulan a través de proteínas G que activan cascadas de segundos mensaxeiros. A activación da proteína G?q provoca a activación do enzima PLC que hidroliza PIP2 en IP3 e DAG. Estes promoven o aumento do Ca+2 intracelular e a activación de proteinquinasas. Viuse que algúns destes segundos mensaxeiros poderían estar implicados na modulación de corrente a través dos canais K2P. No caso das proteínas G?s e G?i o mecanismo de actuación depende dos niveles de AMPC. A activación de G?s aumenta a cantidade de AMPc, mentres que G?i actúa de maneira oposta modulando a corrente a través dos canais. A meirande parte dos estudos sobre esta modulación realizáronse sobre sistemas heterólogos, mentres que son moi poucos os realizados en sistemas autólogos. No presente proxecto pretendese estudar a modulación dos canais da subfamilia TREK a través de proteínas G e o seu efecto sobre o potencial de membrana en repouso e a excitabilidade neuronal en neuronas do ganglio cervical superior de rato en cultivo primario. Para realizar este proxecto utilizaranse técnicas electrofisiolóxicas de “patch-clamp” na súa modalidade de selo perforado e rexistro en canal individual. Os rexistros realizaranse en neuronas do ganglio cervical superior de rato en cultivo. As neuronas de ganglio cervical superior obtéñense de ratos de 20 a 60 días dos cales se extraen os ganglios que despois de ser lavados e tratados con enzimas, disgréganse mecanicamente para individualizar ás células. As neuronas cultívanse en “pocillos” e incúbanse durante 24-48 horas a 37ºC y 5 % de CO2. Transcorrido este tempo realizase o rexistro electrofisiolóxico utilizando un microscopio invertido e un sistema de perfusión constante onde aplícanse as solucións de baño e as drogas. O rexistro realizarase utilizando as técnicas de “patch-clamp” na modalidade de “Whole-cell” na súa variante de selo perforado e no modo “Single-Channel” na configuración de “cell-attached”. Os rexistros realizaranse cun amplificador de “patch” e os datos almacenaranse nun ordenador compatible a través dunha tarxeta convertedora utilizando o programa Clampex. Realizaránse experimentos de fixación de voltaxe para caracterizar as correntes iónicas de repouso e experimentos de fixación de corrente para estudar as variacións do potencial de membrana trala aplicación de distintos fármacos. Os rexistros serán analizados e representados utilizando os programas Clampfit e Origin. Concretamente os experimentos consisten en rexistrar a corrente activada por Riluzole a través dos canais TREK cando se lle aplica en primeiro lugar o agonista do receptor muscarínico Oxotremorina-M. En presenza deste agonista probaranse moduladores selectivos do receptor muscarínico e dos distintos compoñentes da cascada de segundos mensaxeiros co fin de determinar qué compoñentes e cómo están implicados na regulación da corrente a través dos canais K2P.