"Regulación de factores de virulencia por el sistema de quorum sensing AsaI/R en ""Aeromonas salmonicida"" subsp. ""salmonicida"""

Resumo

Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida (A. salmonicida) es un patógeno que provoca pérdidas económicas importantes en la acuicultura. Todos los estudios coinciden al afirmar que las causas de patogenicidad en esta especie dependen de factores de virulencia diversos, y a pesar de ser una especie patógena reconocida desde hace muchos años, aún no se ha logrado entender exactamente su interacción con el hospedador. Los estudios de los mecanismos de quorum sensing (QS) en otros patógenos han hecho plantearse que éstos en A. salmonicida podrían regular la dinámica de expresión de genes de virulencia y otros, marcando la diferencia entre un comportamiento virulento y avirulento de las cepas. En esta tesis doctoral se investigó si el sistema de QS AsaI/R, apenas explorado en A. salmonicida, podría está implicado en la regulación de la expresión de factores de virulencia, el grado de virulencia y la capacidad de producir infección en rodaballo. Asimismo, se estudió cómo interaccionaban los genes asaI y asaR en dicho sistema. En el estudio se aplicaron como herramientas la mutación y la cuantificación de la expresión génica mediante qPCR. Para ello, se emplearon dos cepas de A. salmonicida caracterizadas por presentar: un comportamiento distinto en la virulencia, el mecanismo de QS AsaI/R y los únicos genes que han sido confirmados previamente como esenciales para la virulencia de esta especie, y que son los genes ascC y ascV del sistema de secrecióntipo III. Se emplearon además cepas mutantes para los genes de QS asaI o asaR, y cepas en las que dichas mutaciones fueron complementadas. En todas ellas, se estudió la expresión de los genes de QS y de virulencia, y se analizó si existían diferencias en el grado de virulencia y la capacidad de producir infección en rodaballo. Los resultados obtenidos han aportado información relevante sobre el sistema de QS AsaI/R de A. salmonicida.En ambas cepas, el gen asaI codificó para una AHL sintasa, mientras que el gen asaR fue un regulador positivo, no esencial de dicha actividad. Ninguno de los genes de QS reguló el crecimiento in vitro, ni la expresión de la actividad hemolítica en las cepas estudiadas, pero ambos activaron su capacidad de resistencia a la tetraciclina. El patrón de regulación del gen asaR, además, fue similar en ambas cepas con respecto a la expresión de los genes ascC y ascV, ya que actuó como regulador positivo de los mismos, y la virulencia, pues su regulación estuvo ausente en los ensayos por inoculación intraperitoneal, y en la capacidad de producir infección en rodaballo. Sin embargo, hay indicios de que, en ambas cepas, el gen asaI juega un papel diferente con respecto a: - La expresión de los genes de virulencia ascC y ascV, ya que mientras que en la cepa ACRp 43.1 no reguló su expresión, en la cepa RIM 33.1 actuaría como regulador positivo. - La capacidad de regular la virulencia, mientras que en la cepa ACRp 43.1 no está modulada por este gen, así como tampoco la capacidad de producir infección en rodaballo, en la cepa RIM 33.1 actuaría como regulador positivo. - La actividad proteolítica, ya que mientras que en ambas cepas actuaría como regulador negativo, en la cepa ACRp 43.1 lo haría también como regulador positivo. Estas discrepancias podrían ser la clave para explicar las diferencias en el comportamiento virulento y en la capacidad infectiva de ambas cepas. Además, entre las herramientas empleadas se debe destacar que la cuantificación de la expresión génica mediante qPCR fue una herramienta útil para el estudio de la dinámica de expresión de los genes de QS o virulencia. En su puesta a punto se mostró que el uso combinado de los algoritmos geNorm, NormFinder, y BestKeeper, y el modelo de cuantificación relativa que utiliza los tres genes de referencia más estables, permitieron obtener una cuantificación de la expresión génica más precisa en las cepas de ensayadas. Por otra parte, los programas Real-time PCR Miner o LinReg PCR han mostrado ser una alternativa eficaz a la curva estándar, capaz de estimar la eficiencia de amplificación específica. Todos estos métodos suponen una mejora para la selección de genes de referencia y de modelos de cuantificación para la obtención de datos precisos de expresión génica en bacterias mediante qPCR, con respecto a los métodos ya existentes. Por lo tanto, en estudios futuros, ésta sería la herramienta recomendada para cuantificar la expresión de los genes, en esta especie y en otras bacterias.