Nanodispensadores de fármacos antitumorales basados en nanotubos de carbonodiseño, evaluación y biocompatibilización

Resumen

El uso de nanomateriales (NMs) en medicina tiene el potencial de transformar radicalmente el diagnóstico por imagen [1], los tratamientos antineoplásicos [2,3,4] los sistemas de transporte y administración de fármacos [5,6] los biosensores [7], etc. Existen además muchos ejemplos en la literatura que muestran cómo algunos nanomateriales podrían emplearse como nanocápsulas ya que pueden penetrar a través de los tejidos y entrar en el interior de las células y desde allí detectar y tratar enfermedades [8,9]. Debido a su tamaño y su morfología los nanomateriales tienen además el potencial de interaccionar con polímeros y proteínas interfiriendo con numerosos procesos celulares, ocasionando citotoxicidad, mutaciones del ADN, induciendo daños estructurales a las mitocondrias, o incluso provocando muerte celular por apoptosis [10,11], convirtiéndolos en un arma de doble filo, pudiendo generar enfermedades, detectarlas o curarlas. Los nanotubos de carbono (NTCs) son nanomateriales con excepcionales propiedades en nanomedicina. Estos filamentos tienen la capacidad de interaccionar biomiméticamente con las proteínas presentes en el citoplasma celular, principalmente con los microtúbulos, interfiriendo con los biomecanismos celulares, y provocando efectos antimigratorios [12], antiproliferativos [13] y citotóxicos [14] en las células tumorales in vitro, y efectos antitumorales [15] in vivo. Por otro lado, los nanotubos de carbono son una interesante herramienta como nanotransportadores de fármacos debido a sus excelentes propiedades de superficie, que le permiten enlazar un gran número de moléculas y biomoléculas [16,17] bien sea químicamente o mediante procesos de fisisorción. Otra característica que los hace buenos sistemas de liberación de fármacos, es su capacidad para atravesar cualquier tipo de membrana celular [18,19] permitiendo esto liberar la terapia que transportan en el interior de la célula. Por tanto, los nanotubos de carbono, parecen de partida una interesante herramienta en la lucha contra el cáncer. En la presente tesis doctoral, en primer lugar, se llevó a cabo el estudio del uso de los nanotubos de carbono como nanotransportadores de una droga usada tradicionalmente en la terapia contra el cáncer, el 5-Fluorouracilo (5-FU). El objetivo de este primer estudio es bloquear en dos puntos diferentes el ciclo celular, para de esta forma, potenciar el efecto antitumoral del 5-FU y disminuir la posible aparición de quimioresistencias. El 5-FU es un potente antimetabolito cuyo mecanismo de acción se atribuye a la incorporación errónea de fluoronucleótidos en el ADN y ARN, y a la inhibición de la enzima timidilato sintasa (TS), la cual cataliza la metilación reductiva de la deoxiuridina monofosfato a deoxitimidina monofosfato, reacción que proporciona la única fuente de nuevo timidilato, necesario para la replicación y reparación del ADN. Por tanto, este fármaco bloquea al ciclo celular en fase S. Por otro lado, los NTCs interaccionan con los microtúbulos, inhibiendo su dinámica y bloqueando a la célula en mitosis. Con este doble bloqueo, se pretende conseguir un efecto sinérgico entre los NTCs y el 5-FU. De los resultados obtenidos se concluye que los NTCs potencian el efecto citotóxico del 5-FU in vitro, en células de cáncer de cuello de útero humano (HeLa) y en melanoma maligno de piel de ratón (B16F10), observándose mediante citometría de flujo un importante aumento del bloqueo en fase S y de la apoptosis con respecto a los controles. Además, también se observa un aumento del número de células necróticas al llevar a cabo un ensayo de viabilidad utilizando azul de Trypan y contaje con contador automático. Por otro lado, se estudió el efecto antitumoral en modelos de melanoma sólido en ratones, observándose que los NTCs potencian el efecto del 5-FU cuando este se administra fisisorbido a su superficie. Atendiendo a estos resultados, los NTCs podrían suponer una eficaz herramienta contra el cáncer, tanto por su efecto intrínseco citotóxico y antitumoral, como por sus excelentes propiedades, las cuales les permiten ser utilizados como sistemas de transporte y liberación de fármacos. Desafortunadamente, queda un largo camino antes de que se puedan usar en aplicaciones clínicas debido a su bio-persistencia y a su toxicidad [20,21,22]. El segundo objetivo de esta tesis se centra en la mejora de la biodegradación intracelular de los NTCs. Para ello, se llevaron a cabo diferentes tratamientos de oxidación, y se estudió si los NTCs sometidos a estos tratamientos (en adelante o-NTCs) eran más fácilmente digeridos por las enzimas intracelulares que aquellos que no habían sido oxidados (en adelante p-NTCs). Para realizar este estudio, macrófagos de la línea J774 fueron expuestos a o-NTCs y p-NTCs durante diferentes tiempos. Al cabo de 96 h, los nanotubos se aislaron del interior de las células y se analizaron mediante microscopía electrónica de trasmisión (TEM) y espectroscopía Raman. Los resultados obtenidos mostraron una importante reducción de la longitud de los o-NTCs con respecto al material de partida (o-NTCs que no había estado en el interior de la célula). Por otro lado, cuando se llevó a cabo el mismo estudio para los p-NTCs, no se observaron cambios significativos en sus longitudes tras la exposición a las células. Este resultado indica que los tratamientos previos de oxidación ayudan en la degradación intracelular de los nanotubos. A continuación, se realizó un estudio de la degradación intratumoral in vivo. Para ello, tumores sólidos de melanoma de ratón fueron tratados con una única inyección intratumoral de 2 µg de o-NTCs y de p-NTCs y se analizaron mediante espectroscopía Raman. Se determinó que los o-NTCs presentes en la zona intra y peritumoral presentaban una degradación significativa, 15 días después de la inyección. Esta degradación no se observó en el caso de los p-NTCs. Por otro lado, al evaluar el efecto antitumoral producido por los o-NTCs se observó una reducción del 30 % del peso del tumor con respecto al control (tratado únicamente con medio de resuspensión de los NTCs), esta reducción es exactamente la misma que se produce al tratar el tumor con p-NTCs, por lo que se corrobora que el pretratamiento oxidativo ha mejorado la biodegradación intratumoral de los nanotubos, al mismo tiempo que permite conservar su morfología, principal responsable de su interacción con los microtúbulos y por tanto de su efecto antitumoral. Estos resultados apoyan el potencial del uso de los o-NTCs como agentes antitumorales y revelan interesantes pistas sobre cómo mejorar la eliminación del nanomaterial una vez ejercida su función in vivo. El último objetivo de esta tesis fue el diseño de un sistema más complejo de liberación de multi-terapias contra el cáncer. Este sistema aprovecha todas las propiedades y ventajas mencionadas anteriormente de los NTCs y a la vez mejora algunos de sus inconvenientes. El sistema está basado en un núcleo de sílice mesoporosa (SiO2 MP) sellada con determinados polieletrolitos y todo ello recubierto por nanotubos de carbono biodegradables (o-NTCs). Este sistema cumple todos los requerimientos de un buen sistema de liberación de fármacos incluido: i) reconocimiento celular específico, ii) Preservación de la carga que transporta de las hostiles condiciones presentes en el medio lisosomal, iii) escape endo-lisosomal no letal, iv) transporte de diferentes tipos de moléculas o biomoléculas al citosol, v) sus componentes son biodegradables.   REFERENCIAS. 1. Bae, K. H., Chung, H. J. & Park, T. G. Nanomaterials for cancer therapy and imaging. Molecules and Cells 31, 295–302 (2011). 2. 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