Propiedades biofísicas y farmacología de los canales iónicos TRP sensibles a temperaturaTRPV1, TRPA1 Y TRPM8

Resum

INTRODUCCIÓN La percepción de los estímulos térmicos está mediada por la activación de distintos canales de membrana sensibles a temperatura localizados en terminales sensoriales. El frío y compuestos refrescantes, como el mentol activan en dichas neuronas sensoriales una corriente catiónica no selectiva mediada por la apertura de TRPM8. El calor y compuestos vaniloides como la capsaicina activan una corriente biofísicamente similar pero debida a la apertura del canal TRPV1, mientras que sustancias como la alicina, aceite de mostaza o cinamaldehído activan el canal iónico TRPA1, el cuál se postula como candidato a mediar en la transducción del frío extremo La implicación de TRPV1 en nocicepción y su validación como una prometedora diana de agentes terapéuticos contra el dolor, han situado en el punto de mira a otros canales iónicos TRP termosensibles e implicados en nocicepción, como son TRPM8 y TRPA1, cuya farmacología, así como su potencial terapéutico son menos conocidos. La necesidad de búsqueda de nuevos agonistas y antagonistas más selectivos para TRPV1, TRPM8 y TRPA1, que ayuden a un mayor conocimiento de las bases moleculares de la transducción térmica y nocicepción, y a aumentar el potencial terapéutico para el tratamiento clínico del dolor, han motivado el desarrollo de este trabajo de tesis doctoral OBJETIVO Caracterizar agonistas y antagonistas farmacológicos de la actividad de los canales iónicos TRPV1, TRPA1 y TRPM8. MATERIALES Y MÉTODOS El estudio farmacológico de los canales iónicos TRPV1, TRPA1 y TRPM8 presentado en esta memoria se realizó mediante el uso de la técnica electrofisiológica conocida como patch clamp, en su modalidad de registro de corriente de célula entera y de la técnica de imagen de calcio basada en la fluorimetría de fura-2. Ambos tipos de estudio se realizaron con líneas celulares de mamífero HEK293, CR-1 y CHO, como sistemas de expresión heteróloga de TRPV1, TRPA1 o TRPM8 al ser expresados de forma transitoria o estable mediante la transfección de las células con ADN plasmídico conteniendo las secuencias de nucleótidos codificantes de los respectivos canales iónicos. Como modelo experimental de expresión nativa de los canales iónicos se usaron neuronas sensoriales primarias de ganglio trigémino en cultivo, obtenidas mediante la extracción de los ganglios trigéminos de ratones o cobayas y la posterior disociación química y mecánica de las neuronas para establecer un cultivo primario sobre el que se realizaron registros de imagen de calcio. Las condiciones ambientales de las células se mantuvieron constantes en un incubador con la temperatura estabilizada a 37 ° C y la humedad controlada en una atmósfera de CO2 del 5%. Para el estudio de la conducta nociceptiva, se usó el modelo de dolor inducido por la inyección intraplantar de los compuestos y el ensayo en placa caliente para evaluar la inducción de hiperalgesia térmica en ratones adultos. RESULTADOS 1. El agente antifúngico clotrimazol produce un incremento de la concentración de calcio intracelular y de las corrientes catiónicas mediadas por los canales iónicos TRPV1 y TRPA1 en sistemas de expresión heteróloga. Además, este efecto agonista se acompaña de un desplazamiento de la curva de activación hacia valores de potencial de membrana más negativos, dentro del rango fisiológico. 2. El clotrimazol incrementa la concentración de calcio intracelular de una subpoblación de neuronas en cultivo procedentes de ganglio trigémino de ratón, a través de la activación de los canales iónicos TRPV1 y TRPA1 expresados de forma nativa. 3. El clotrimazol produce comportamiento de dolor e induce hiperalgesia térmica en el test de dolor por inyección intraplantar y de placa caliente respectivamente, en ratones con genotipo silvestre. La aplicación conjunta del clotrimazol y de BCTC atenúa esta conducta de dolor en estos mismos ratones. Además, la inyección del clotrimazol no produce conducta de dolor ni hiperalgesia térmica en ratones nulos para el gen trpv1. Todo ello indica que la activación del canal iónico TRPV1 es responsable de la conducta observada. 4. El clotrimazol inhibe la señal de calcio intracelular e inhibe la corriente catiónica mediada por TRPM8 en respuesta a mentol en sistemas de expresión heteróloga. Este efecto antagonista se acompaña de un desplazamiento de la dependencia de voltaje de activación hacia valores de potencial de membrana más positivos, alejados del rango fisiológico. 5. El clotrimazol inhibe la señal de calcio intracelular en respuesta a mentol y mediada por TRPM8, mientras que no inhibe o potencia la señal de calcio intracelular en respuesta a mentol y mediada por TRPA1 en neuronas en cultivo de ganglio trigémino de ratón adulto. 6. El compuesto químico BCTC inhibe la corriente catiónica mediada por TRPM8 en respuesta a frío y mentol en sistemas de expresión heteróloga. Este efecto antagonista se explicaría por un desplazamiento de la dependencia de voltaje hacia valores de potencial de membrana más positivos, impidiendo su apertura a valores fisiológicos del potencial de membrana. 7. El BCTC inhibe completamente la señal de calcio intracelular mediada por TRPM8 en respuesta a mentol, y parcialmente a frío, en una subpoblación de neuronas en cultivo sensibles a la aplicación de mentol y procedentes de ganglio trigémino de cobaya neonato. 8. El BCTC produce un incremento de la concentración de calcio intracelular y de la corriente catiónica mediada por el canal iónico TRPA1 en sistemas de expresión heteróloga. 9. Los compuestos químicos SKF963565 y 1,10 fenantrolina inhiben la corriente catiónica mediada por TRPM8 en respuesta a frío en sistemas de expresión heteróloga. Este efecto antagonista se acompaña de un desplazamiento de la dependencia de voltaje hacia valores de potencial de membrana más positivos. 10. Los compuestos químicos nifedipina y BAYK8644, dos conocidas 1,4 dihidropiridinas, incrementan la corriente catiónica mediada por TRPA1 en sistemas de expresión heteróloga. 11. La nifedipina incrementa la concentración de calcio intracelular de una subpoblación de neuronas en cultivo procedentes de ganglio trigémino de ratón adulto, a través del canal iónico TRPA1 expresado de forma nativa. 12. La nifedipina no produce comportamiento de dolor en el ensayo de inyección intraplantar, pero el BAYK8644 si, lo que sugiere que el efecto inhibidor de la nifedipina sobre las corrientes de Ca2+ dependientes de voltaje en neuronas sensoriales periféricas, neutraliza el posible efecto excitador mediado por la activación de TRPA1 en las mismas neuronas.