Síntesis de gliconanopartículas magnéticas para aplicaciones biomédicas

Resumo

En este trabajo se muestra la síntesis de nanopartículas (NPs) magnéticas para su uso en biomedicina. Para ello es necesario sintetizar las NPs, transferirlas a agua, estudiar su toxicidad in vitro y su biodistribución in vivo. En esta tesis se han sintetizado NPs de 6 y 8 nm de óxido de hierro mediante el método de descomposición térmica de acetilacetonato de hierro. Para poder utilizar estas NPs en aplicaciones biológicas, las NPs se han transferido a agua utilizando diversos métodos previamente descritos en la literatura. De todos, se ha demostrado que el uso de un polímero anfifílico (PMAO) permite transferir a agua distintos tipos de NPs hidrofóbicas con un rendimiento cercano al 100%. Las NPs en agua son monodispersas, estables en soluciones acuosas en un amplio rango de pHs y condiciones salinas y no agregan con el tiempo. Las NPs pueden ser funcionalizadas tanto en medio orgánico antes de ser transferidas a agua como en medio acuoso. Las condiciones de funcionalización han sido optimizadas para poder incorporar a la superficie de las mismas tanto monosacáridos como polietilenglicol (PEG), así como la combinación de estas moléculas con moléculas fluorescentes. Por otra parte, se ha puesto a punto una metodología para evaluar de manera sencilla si la densidad de agentes bloqueantes incorporados en la superficie de la NP es adecuada para evitar la adsorción inespecífica de proteínas. Los monosacáridos han resultado ser tan efectivos como el PEG bloqueando la adsorción de las proteínas en estos estudios llevados a cabo in vitro. La citotoxicidad de las NPs in vitro ha sido estudiada a diferentes niveles. Tras analizar la viabilidad celular utilizando distintas líneas celulares, la generación de especies reactivas de oxígeno, la progresión del ciclo celular y la activación del sistema del complemento, se ha podido determinar que estas NPs parecen biocompatibles, al menos in vitro. El modo de funcionalización elegido para funcionalizar las NPs con moléculas fluorescentes y moléculas bloqueantes (PEG o monosacáridos) puede dar lugar a diferentes patrones de internalización celular. Cuando la densidad de agentes bloqueantes es la correcta, las glico-NPs son internalizadas por la célula, mientras que las NPs con PEG no acceden al interior celular. Las NPs funcionalizadas con glucosa (glu-NPs), por su parte, son rápidamente internalizadas, mientras que las NPs funcionalizadas con galactosa tardan más tiempo, por lo que se propone un mecanismo de interacción específica de las glico-NPs con las células Vero. El estudio con inhibidores farmacológicos de la endocitosis de las glu-NPs demuestra una ruta mediada por dinamina y balsas lipídicas, la cual es corroborada al colocalizar las NPs con un marcador típico de estas rutas como es la toxina colérica. La endocitosis mediada por caveolas, ruta que posee estas características, no ha podido ser demostrada mediante immunofluorescencia utilizando anticuerpos anti caveolina-1. Por último, la biodistribución de las NPs funcionalizadas con PEG o monosacáridos ha sido estudiada preliminarmente in vivo mediante RMI en ratones sanos. Las NPs dan buen contraste en RMI, y pueden ser observadas en hígado a los pocos minutos de la inyección intravenosa. Por otro lado, se ha observado que las NPs pueden ser excretadas por el riñón con el paso del tiempo. Además, en ensayos preliminares in vivo se ha confirmado que las glu-NPs pueden acumularse en un tumor renal inducido en ratón. A pesar de esta acumulación en el tumor, las NPs siguen siendo captadas por el bazo y el hígado. Por otra parte, las glico-NPs han demostrado ser una buena plataforma multivalente para estudiar las interacciones carbohidrato-lectina. La afinidad entre una lectina modelo y las glu-NPs se ha podido caracterizar mediante los cambios de relajación T2 de los protones del agua utilizando un relaxómetro. Por otra parte, utilizando esta técnica se ha podido caracterizar por primera vez la especificidad de una nueva lectina de origen fúngico hacia glucosa, lo cual no había sido posible con métodos tradicionales de caracterización de lectinas (hemaglutinacion y cromatografía de afinidad).