Inmovilización de lacasamétodos y potenciales aplicaciones industriales

Resumo

La utilización de enzimas en el sector industrial supone un gran avance para muchos procesos antes realizados mediante reacciones químicas. Desde el punto de vista ambiental la utilización de enzimas en lugar de otro tipo de catalizadores para reacciones de tipo industrial mejora notablemente el impacto ambiental que generan este tipo de procesos. El empleo de estos biocatalizadores está limitado por su escasa estabilidad y alto coste, por lo que la inmovilización de enzimas podría superar estos inconvenientes. Las lacasas son enzimas pertenecientes al grupo de las oxidorreductasas que han sido estudiadas desde el siglo XIX. Se encuentran presentes en varios tipos de plantas e insectos, pero su principal fuente se localiza en los hongos causantes de la degradación de la madera. El mecanismo de acción de las lacasas se basa en la oxidación simple de cuatro electrones presentes en el sustrato con la consecuente reducción de una molécula de oxígeno molecular a agua. Son capaces de oxidar compuesto fenólicos y aminas aromáticas, lo cual implica que exista un extenso rango de sustratos susceptibles de ser oxidados por las lacasas. La función fisiológica de las lacasas es diferente dependiendo del organismo productor, aunque todas ellas tienen la capacidad de llevar a cabo procesos de degradación o polimerización. Esta característica las convierte en enzimas muy vérsatiles para ser utilizadas en un gran número de aplicaciones industriales como el blanqueamiento de la pasta de papel en la industria papelera, la degradación de compuestos xenobióticos presentes en efluentes contaminados, la producción de fármacos o como biosensor de compuestos fenólicos en la industria alimentaria. La ventajosa utilización de estas enzimas para aplicaciones medioambientales y biotecnológicas es obvia, pero su baja estabilidad ante condiciones adversas y su alto coste de producción limitan su empleo. La inmovilización enzimática se define como la retención física de proteínas en un lugar confinado del espacio o mediante la unión a un soporte insoluble, el cual mantiene su actividad y posibilita su reutilización. La inmovilización de las lacasas puede superar alguna de las limitaciones anteriormente expuestas, mejorando significativamente sus propiedades enzimáticas. En el capítulo I de esta tesis se realiza una revisión de diferentes métodos de inmovilización para las lacasas procedentes de los hongos Myceliophthora thermophila y Trametes villosa basados en distintos métodos físicos o químicos. Se seleccionó el método físico de inmovilización por atrapamiento en esferas de alginato para la inmovilización de la lacasa de M. thermophila. Se testaron diferentes tipos de esferas de alginato y distintas concentraciones de este. Una vez atrapada la lacasa se realizaron ensayos de estabilidad para cada uno de los tipos de esferas, determinando cuales de ellas presentaban una mayor actividad y una mayor estabilidad en cuanto a la retención de la enzima. Se evaluaron también métodos de inmovilización basados en el enlace covalente entre la lacasa y el soporte. En primer lugar se llevó a cabo la inmovilización de la lacasa de M. thermophila sobre soportes de silica previamente silanizados y activados con el compuesto glutaraldehído. Se realizó un estudio de la silanización de estos soportes, determinando cual era el mejor método para obtener un mayor nivel de moléculas de silano en la superficie de éstos. De igual forma se realizaron experimentos para determinar el porcentaje de glutaraldehído y la cantidad de enzima óptimos en el proceso de inmovilización, con el fin de obtener soportes con mayor actividad y mayor estabilidad térmica y ante distintas condiciones de pH. Además de realizarse los ensayos sobre soportes de silica naturales como caolinita, celita o perlita, también se llevó a cabo la inmovilización sobre el soporte comercial CPC-silica ya silanizado. Con el fin de encontrar un método y un soporte alternativos para la inmovilización covalente de lacasas, la agarosa fue escogida como soporte para, en este caso, inmovilizar las lacasas de T. villosa y M. thermophila. Estos ensayos de inmovilización se llevaron a cabo en el laboratorio de Ingeniería Enzimática del Insituto de Catálisis y Petroleoquímica (ICP) dirigido por el Profesor José Manuel Guisán, perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). En primer lugar se determinaron los modelos estructurales de ambas enzimas con el fin de conocer su composición de aminoácidos de superficie. La densidad superficial de los distintos tipos de aminoácidos presentes en la proteína determinará qué tipo de grupos funcionales son necesarios en el soporte para su inmovilización. Para cada una de las enzimas se crearon soportes de agarosa con diferentes grupos funcionales en su superficie. Los distintos grupos funcionales promovieron la adsorción de las enzimas mediante la interacción con aminoácidos específicos, orientándose de diferentes formas. Una vez la enzima estuvo orientada, la unión covalente posterior se realizó de distintas formas, siendo la más importante el enlace multipuntual entre la enzima y el soporte. La unión multipuntual entre las lacasas y el soporte de agarosa se realizó mediante el enlace entre los grupos nucleófilos de las lisinas presentes en las lacasas y los grupos aldehído del soporte, rigidificando la estructura terciaria de la proteína. La utilización de distintos derivados se realizó con la intención de analizar el nivel de inmovilización alcanzado en cada uno de ellos, la actividad que presentaron y la influencia de la orientación de la enzima con respecto al soporte a la hora de valorar su estabilidad frente a diferentes factores. De esta forma, se promovió así la mejora de su estabilidad ante distintas condiciones de temperatura, pH y presencia de compuestos orgánicos. Además se intentó incrementar más la estabilidad de los derivados obtenidos mediante la adición de diversos aditivos como polímeros, azúcares, alcoholes o aminoácidos al medio de reacción. Los mejores derivados obtenidos fueron sometidos a pruebas de reutilización, verificando que el uso en continuo o en repetidas ocasiones de las lacasas inmovilizadas es posible. Los siguientes capítulos de esta tesis abarcan distintas aplicaciones posibles para ambas lacasas procedentes de T. villosa y M. thermophila en su estado inmovilizado, centrándose principalmente en la utilización de la lacasa de M. thermophila, debido a que sus propiedades permiten utilizarla a temperaturas elevadas y es más activa a pH neutros. En el capítulo II se llevaron a cabo estudios sobre el comportamiento enzimático de las lacasas de T. villosa y M. thermophila en presencia de diferentes líquidos iónicos, tanto en su estado libre como inmovilizado. Los líquidos iónicos son sales orgánicas que se encuentran en estado líquido a temperatura ambiente. Son compuestos no acuosos que durante los últimos años han tenido gran importancia por ser sustitutos de los disolventes orgánicos tradicionales. Su baja volatilidad, su alta estabilidad térmica y química y que no son inflamables hacen que estos compuestos resulten una alternativa muy atractiva. Existe una gran variedad de compuestos solubles en los líquidos iónicos. Las enzimas pueden llevar a cabo reacciones catalíticas en presencia de estos compuestos. Las soluciones de mezcla de agua con líquidos iónicos pueden aumentar la solubilidad de reactivos y productos, en este caso en reacciones llevadas a cabo por las lacasas. En algunos casos, las enzimas que se encuentran en presencia de líquidos iónicos, mejoran notablemente su actividad, estabilidad y selectividad. Conocer de forma exacta que efecto podrían tener algunos líquidos iónicos sobre las lacasas que se encuentran bajo estudio en esta tesis fue el objetivo de este capítulo, prestando atención a los resultados obtenidos para las lacasas inmovilizadas. Para ello se llevaron a cabo estudios de estabilidad de ambas lacasas en presencia de distintas concentraciones de varios líquidos iónicos. Además se realizó el estudio de los parámetros cinéticos y la termoestabilidad de la lacasa procedente del hongo M. thermophila en presencia del líquido iónico 1-etil-3-metilimidazolio etilsulfato. Estos ensayos se llevaron a cabo durante una estancia en el grupo de la Profesora Eugénia A. Macedo del Laboratorio de Separación e Ingeniería de las Reacciones (LSRE) de la Facultade de Engenharia de la Universidade do Porto. Todos los ensayos se realizaron para las lacasas libres e inmovilizadas, determinando las diferencias en su comportamiento enzimático. La posibilidad de utilizar las lacasas en presencia de líquidos iónicos ofrece la oportunidad de utilizar estos compuestos como elementos que mejoran la solubilidad de sustancias como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), que son susceptibles de ser biodegradados por parte de estas enzimas. El primer paso para que esta suposición sea posible fue determinar si la lacasa de M. thermophila inmovilizada tiene la capacidad de degradar u oxidar alguno de estos compuestos. En el capítulo III se valoró la biodegradación de HAPs por parte de esta enzima en su estado libre e inmovilizado mediante el sistema lacasa-mediador. Los HAPs son contaminantes ambientales que tienen su origen en fuentes naturales o antropogénicas. Se consideran excelentes marcadores de contaminación y se encuentran presentes tanto en la atmósfera como en el suelo, pero los vertidos tóxicos generados por la industria hacen que se encuentren muy presentes en aguas. Su naturaleza cancerígena y mutagénica, en conjunto con su amplia distribución, hacen que la eliminación o remediación de los HAPs sea de gran importancia. La oxidación de HAPs mediante lacasa depende de qué sistema lacasa-mediador se utilice y la estructura, potencial de ionización y solubilidad del HAP bajo estudio. La capacidad de las lacasas para la biorremediación de estos compuestos puede verse mejorada si la enzima se encuentra inmovilizada. En este trabajo se valoró la capacidad de la lacasa de M. thermophila para eliminar benzo[a]antraceno, pireno, benzo[a]pireno, fluoranteno y fenantreno, pertenecientes a la lista creada por la EPA considerándose contaminantes prioritarios. Los resultados demostraron que se obtuvieron mayores niveles de oxidación para el benzo[a]pireno y benzo[a]antraceno. Se valoró la biorremediación por parte de la lacasa inmovilizada en soportes de agarosa y la reutilización de esta con el fin de poder ser utilizada en continuo para la biorremediación de efluentes industriales contaminados con los HAPs mencionados. Además de la capacidad de las lacasas para la eliminación de compuestos contaminantes, su principal función en sus organismos productores, los hongos ligninolíticos, permite su utilización en la industria papelera y maderera llevando a cabo las reacciones que realizan en su medio natural. Los hongos de podredumbre de la madera han sido los más estudiados, precisamente porque las enzimas que éstos producen tienen mucho interés biotecnológico en las industrias antes mencionadas. Las lacasas producidas por estos microorganismos catalizan la despolimerización de la lignina mediante la oxidación de grupos fenólicos a sus radicales. Esta acción provoca la degradación de la madera, disminuyendo sus propiedades de resistencia y por tanto siendo perjudicial para las estructuras de madera expuestas a su vez a condiciones de humedad. Ambos factores de deterioración de la madera, la degradación por hongos y la humedad, están muy relacionados entre sí. Se ha comprobado que las lacasas pueden despolimerizar la lignina, pero además tienen la capacidad de polimerizar monolignoles en presencia de oxígeno molecular. Esta capacidad puede utilizarse para la activación de las fibras de la madera o de diferentes productos lignocelulósicos para que compuestos fenólicos activados, también por la lacasa, se unan y proporcionen así nuevas propiedades a productos madereros o sus derivados. Este mecanismo de unión de pequeñas moléculas a polímeros es conocido como grafting. Las lacasas tienen la capacidad de oxidar un sustrato adecuado creándose un radical que posteriormente realiza reacciones no enzimáticas por sí sólo, generando la degradación de polímeros o creando uniones covalentes con polímeros como la lignina. Es conocida la capacidad biocida de varios compuestos fenólicos. La protección de la madera ante el ataque por hongos o insectos se ha realizado mediante la aplicación de compuestos protectores como la creosota, el pentaclorofenol o el arseniato de cobre cromado. Durante las últimas décadas se han buscado compuestos libres de metales pesados o métodos no biocidas. Un método alternativo a los comúnmente utilizados sería la modificación química de la madera. Esta modificación de la madera mediante la unión estable de compuestos que eviten la degradación por hongos y mejoren la hidrofobicidad de esta es posible gracias al grafting mediante lacasas. Esta unión estable con los compuestos preservantes ofrece la ventaja de ser un tratamiento más respetuoso con el medio ambiente, evitando su lavado y posterior exposición al medio, como ocurre con los compuestos utilizados hasta ahora. De esta forma, a lo largo del capítulo IV se valoró la funcionalización de madera con fines preservantes frente a la degradación por parte de hongos de podredumbre y proporcionando nuevas propiedades como la hidrofobicidad. Para ello, madera de diferentes especies fue tratada mediante la aplicación de la lacasa de M. thermophila y diversos compuestos fenólicos. En primer lugar se quiso determinar si el tratamiento de grafting mediante lacasa es capaz de unir de forma covalente o estable los compuestos fenólicos a la superficie de la madera a tratar. Para ello láminas de madera procedente de haya (Fagus sylvatica) fueron tratadas con lacasa y el compuesto clorado 4-cloro-2-metoxifenol. Tras el tratamiento y un lavado exhaustivo con acetona se determinó si el compuesto continuó presente en la superficie de la madera. Los resultados del análisis mediante espectroscopía fotoelectrónica de rayos X mostraron cambios en la ratio O/C de la madera, la aparición de cloro en la composición elemental y cambios en la capacidad de adsorción de la lacasa, permitiendo determinar que la lacasa tiene la capacidad de unir de forma estable el compuesto a la madera. En este caso, los estudios se realizaron utilizando un compuesto sencillo de detectar para técnicas de análisis de superficie ya que posee cloro, pero deja claro que la unión puede ser posible para cualquier otro compuesto fenólico susceptible de ser activado mediante la lacasa. Sabiendo que algunos compuestos fenólicos que resultan tóxicos para organismos que atacan la madera podrían ser unidos de forma estable a la superficie de esta, se llevaron a cabo ensayos de resistencia a la degradación por hongos de podredumbre de la madera. Se realizaron ensayos no normalizados en los que la madera a tratar provino de especies residentes en el noroeste de la Península Ibérica: Eucalyptus globulus, Pinus pinaster y Pinus radiata. Los ensayos normalizados fueron realizados en el Instituto Nacional de Investigación de Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Se siguieron los pasos establecidos en la norma europea CEN 113, donde las especies de madera empleadas fueron Pinus sylvestris y Fagus sylvatica. La madera fue tratada con tres compuestos fenólicos diferentes, siendo expuesta posteriormente al contacto con los hongos de podredumbre de la madera Trametes versicolor, Coniophora puteana, Postia placenta, Gloephyllum trabeum y un hongo aislado y no identificado denominado AJN1. Tras el periodo de exposición establecido por la norma se determinó cuál de los tratamientos llevados a cabo fue efectivo mejorando la resistencia a la biodegradación por parte de los hongos ensayados, observando si la presencia de lacasa produjo un efecto positivo. Otro objetivo pretendido mediante la acción de las lacasas y compuestos fenólicos sobre la superficie de la madera fue mejorar la hidrofobicidad de ésta. En la actualidad la hidrofobización de la madera mediante aceites, ceras o resinas no se consideran procesos sostenibles medioambientalmente ni rentables para la política de ahorro de las industrias. Por ello, el trabajo realizado en este apartado se basó en la unión permanente mediante grafting con lacasa del compuesto hidrofóbico lauril galato a chapas de madera procedente de F. sylvatica. La valoración del nivel de hidrofobicidad de la madera y el efecto de los tratamientos ensayados se realizó mediante la medida del ángulo de contacto de una gota de agua en la superficie de la madera. Se valoró el efecto de pretratamientos con tampón y solución de lignina. Se determinó qué concentración de lauril galato fue la óptima para obtener resultados positivos y reproducibles. Estos resultados fueron verificados mediante análisis de medidas de ángulo de contacto, espectroscopía fotoelectrónica de rayos X y espectroscopía infrarroja. El último paso en el desarrollo de estos ensayos fue comprobar si la lacasa inmovilizada podría actuar como biocatalizador para las reacciones de grafting sobre madera. Se realizaron ensayos en los que la agarosa y la madera permanecieron juntos durante la reacción con el lauril galato y ensayos en los que la lacasa estaba en contacto con el lauril galato y este compuesto oxidado se posteriormente en contacto con la madera. Por último, enfatizar que los objetivos principales de esta tesis han sido la obtención de un derivado de lacasa inmovilizada adecuado, que mejorase la estabilidad de esta en distintas condiciones adversas y permitiese la reutilización del mismo. Así mismo se han probado estos derivados de lacasas en distintos medios y ambientes, comprobando si actuaron de forma adecuada para su empleo en varias aplicaciones industriales, lo que permitiría una mejora de los procesos desde el punto de vista del respeto por el medio ambiente.