Causas del polimorfismo de color en poblaciones naturales de "Littorina fabalis"

Resumo

La presente Tesis Doctoral está dividida en cinco capítulos, cada uno compuesto por una introducción, una sección de materiales y métodos, una sección de resultados y una discusión. Además, se introducen los distintos aspectos más relevantes utilizados para la realización de los distintos capítulos en una introducción general, que sigue al presente resumen, así como los objetivos principales. La Tesis finaliza con una sección de conclusiones donde se listan los principales méritos del trabajo y con la lista completa de las referencias utilizadas para documentar el proceso de investigación. Los análisis y el material complementario al cuerpo principal de la Tesis se recogen en la sección de Anexos. Gran parte de los estudios evolutivos tratan, en esencia, de comprender la forma en la que la composición genética de una o varias poblaciones varía en el tiempo. Entre las fuerzas evolutivas que pueden explicar dicho cambio se encuentran: la mutación, el flujo génico, la deriva genética y la selección natural. A menudo, para explicar la variación en un determinado carácter, es necesario estudiar las cuatro ya que todas pueden tener un efecto en dicha variación. La fuerza relativa de cada una de ellas determinará en último término la forma en la que evolucionará el carácter. De las cuatro fuerzas anteriores la más importante, es sin duda, la selección natural pues es la que consigue fijar las características que permiten sobrevivir a las poblaciones naturales en los distintos ecosistemas. La selección natural puede ser direccional, disruptiva, estabilizadora o, en aquellos casos en los que la diversidad genética se mantiene en el tiempo, equilibradora. Además, la selección natural actuando en relación a los distintos caracteres se puede descomponer en cuatro componentes: la fecundidad, la selección gamética, la selección sexual y la viabilidad. La selección sexual, en particular, ha despertado mucho interés ya que, como el propio Darwin observó en su momento, no parece tener relación con la supervivencia del individuo. Es por esto que en el pasado la selección sexual se ha considerado al margen de la selección natural pero dado que junto con las otras tres componentes explica la permanencia de un carácter en el tiempo, hoy en día es más común considerarla dentro de la selección natural. Una de las formas por las que se puede observar selección sexual para un determinado carácter es mediante la preferencia sexual; ésta describe la tendencia de un sexo por aparearse con individuos del otro sexo con características particulares. En el gasterópodo marino Littorina fabalis se ha observado la existencia de un apareamiento asociativo negativo causado por una preferencia sexual hacia determinados colores de la concha ejercida por los machos de esta especie. El hecho de que dicho polimorfismo de color se haya mantenido estable durante un periodo largo de tiempo sugiere la existencia de un mecanismo de selección sexual dependiente de las frecuencias causado por dicha preferencia. Por todo esto, el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral es estudiar los mecanismos por los cuales el polimorfismo de color de la concha observado en L. fabalis, se mantiene estable en el tiempo y sus implicaciones a nivel evolutivo. A continuación paso a detallar los principales méritos de cada uno de los capítulos, además de los retos que surgen de esta Tesis para poder mejorar nuestro conocimiento acerca de los mecanismos que controlan la variabilidad genética de las poblaciones y con particular atención a aquellos que están relacionados con la selección sexual. El Capítulo 1 es resultado de una observación simple y es que el polimorfismo de color de la concha en L. fabalis está presente en varias poblaciones gallegas además de en otras poblaciones del Reino Unido (Reimchen, 1979), Suecia (Tatarenkov & Johannesson, 1998) y el Mar Blanco (sin publicar). La presencia de dicho polimorfismo en zonas tan distantes sugiere que éste debe estar sujeto a la acción de algún mecanismo conservado que mantiene las frecuencias de color en valores intermedios en las poblaciones. Debido al bajo nivel de migración esperado entre poblaciones dado el desarrollo directo y baja movilidad de L. fabalis, los cambios en frecuencia de los distintos caracteres en estas poblaciones estarían sujetos principalmente a mecanismos de deriva genética y selección natural. Para estudiar el grado de influencia de dichos mecanismos en las poblaciones de L. fabalis se utilizaron datos moleculares (genotipos de loci microsatélite facilitados por el Dr. Rui Faria de la Universidad de Oporto) y de color de la concha de cinco poblaciones de las costas gallegas. Con estos datos realizamos una descripción del polimorfismo de color de las cinco poblaciones y un reanálisis de la estructura genética, habiéndose descrito ésta en más detalle en Carvalho et al. (2016). Para la comparación entre las cinco poblaciones se estudió el grado de diferenciación genética (FST) mediante los loci microsatélite (carácter que a priori es neutro), y el grado de diferenciación fenotípica (PST) mediante el polimorfismo de color de la concha. La principal conclusión de este primer capítulo fue que la deriva genética, en forma de aislamiento por distancia, si bien explica la diferenciación entre poblaciones para caracteres neutros (loci microsatélite), no puede explicar las pocas diferencias observadas en frecuencias de color entre dichas poblaciones, lo que apunta a un mecanismo de selección natural equilibradora actuando en las poblaciones de L. fabalis de las costas gallegas. El segundo capítulo corresponde al aspecto más central de esta Tesis y trata de investigar cuál sería el mecanismo de selección natural perfilado en el Capítulo 1 que actúa sobre las frecuencias de color en L. fabalis. Para esto se utilizaron los datos recogidos durante seis años de muestreos en la población de L. fabalis de Abelleira, localizada en la Ría de Muros e Noia. Cada muestreo consistió en la recogida de cópulas o parejas de L. fabalis y de los individuos no apareados más cercanos a cada cópula en la zona de algas pardas del intermareal rocoso. Para cada año pudimos hacer una estima de dos componentes de eficacia para los caracteres color y patrón de bandas de la concha: 1) selección sexual y 2) viabilidad. Además también pudimos estimar el grado de apareamiento asociativo, la frecuencia relativa de cada color y de individuos bandeados y la frecuencia de los ataques por cangrejos en cada color. Los estudios estadísticos sobre la eficacia se llevaron a cabo utilizando el estimador de productos cruzados W, que es una medida del grado de eficacia de uno de los fenotipos del carácter relativo al otro. Se llevaron a cabo regresiones de la eficacia (sexual y viabilidad) en la frecuencia de uno de los fenotipos para detectar patrones de selección dependiente de las frecuencias. También realizamos estimas parciales de apareamiento asociativo y selección sexual. Estudiando la selección sexual en la población de Abelleira encontramos un patrón de selección negativa dependiente de las frecuencias de color en las hembras mientras que en los machos no. Tampoco se encontró patrón alguno utilizando las estimas de viabilidad del color, ni utilizando las estimas de selección sexual del patrón de bandas. El mismo patrón sí que se encontró estimando la eficacia mediante los cambios de frecuencia del color en intervalos de un año, pero no fue significativo. Por el contrario sí lo fue atendiendo al patrón de bandas. De esta forma, obtuvimos evidencias de un patrón de selección sexual dependiente de las frecuencias negativa y de selección apostática. Además, de igual forma que en trabajos previos (Rolán-Alvarez et al., 2012, 2015b), las estimas de apareamiento fueron negativas presentando una tendencia al apareamiento entre diferentes fenotipos (clases distintas de color), lo cual también explicaría el mantenimiento del polimorfismo. Las estimas parciales de apareamiento confirmaron que las parejas entre colores distintos son más frecuentes que las parejas de individuos del mismo color, mientras que las estimas parciales de selección sexual indican que los machos de colores claros tienen una propensión menor al apareamiento. Dado este último resultado se esperaría un patrón de selección direccional en el carácter de color en machos, sin embargo éste no se observa. La explicación más plausible sería que el apareamiento asociativo negativo es lo suficientemente fuerte como para evitar que se pierda uno de los colores en machos. La relación entre la selección sexual y el apareamiento asociativo es uno de los principales interrogantes que surgen de los resultados del Capítulo 2 y algunas hipótesis se recogen en la discusión. Ambos mecanismos pueden ser consecuencia de la existencia de una preferencia sexual en la población (Gavrilets, 2004) o haber evolucionado de forma independiente. Los resultados parecen indicar que la primera hipótesis sería la más probable. De esta forma una preferencia por hembras de distinto color de concha causaría un apareamiento asociativo negativo y una selección sexual sobre éstas de tal forma que el tipo más frecuente tuviese la menor eficacia. Que la preferencia sea ejercida por el macho se basa en el comportamiento de seguimiento de rastro de moco que deja la hembra y en que ésta, salvo excepciones, es sexualmente pasiva (Saltin et al., 2013). Las causas de tal preferencia son uno de los principales aspectos que se discuten en el Capítulo 2 y plantean diversas líneas de investigación a proseguir. Algunas de las posibles causas se estudian posteriormente en el Capítulo 4. Como el modelo de herencia del carácter color de la concha en L. fabalis no está del todo claro, en el Capítulo 3 estudiamos cómo podrían afectar diferentes bases genéticas para el color a la capacidad de la preferencia sexual negativa de mantener el polimorfismo en el tiempo. Para esto realizamos un modelo para distintos modos de herencia genética. En primer lugar, se obtuvieron las frecuencias genotípicas esperadas asumiendo dichos modelos. Se obtuvieron también las frecuencias de los distintos tipos de pareja para dos fenotipos asumiendo apareamiento aleatorio. En segundo lugar, utilizando esas frecuencias, se obtuvieron las frecuencias de parejas esperadas bajo distintos niveles de preferencia negativa y positiva. Por último, se estimó la eficacia sexual y se hizo una regresión de ésta en las frecuencias de los genes y de los fenotipos. Los resultados muestran la inalterabilidad del mecanismo de apareamiento asociativo negativo para explicar el mantenimiento de las frecuencias del fenotipo ante los distintos modelos de herencia. Una de las hipótesis por las que puede evolucionar un apareamiento asociativo negativo es como mecanismo contra la depresión consanguínea. Otra sería como forma de incrementar la eficacia de la descendencia cuando ésta está relacionada con el nivel de heterozigosidad del individuo. En el Capítulo 4 se estudiaron ambas hipótesis utilizando marcadores moleculares neutros (loci microsatélite). Para la primera, analizamos el genotipo de ocho loci microsatélite en los individuos de L. fabalis muestreados en 2014. Mediante el software METAPOP se obtuvo la matriz de parentesco entre cada par de individuos (565x565) y con ayuda de un programa proporcionado por el Dr. Armando Caballero se pudieron obtener a partir de dicha matriz los parentescos para cada microárea y de cada pareja. Estudiamos si había diferencias significativas entre el parentesco de cada pareja y el parentesco de la microárea a la que pertenecían. También testamos si el parentesco entre parejas homotípicas difería del parentesco entre parejas heterotípicas. Para testar la hipótesis que relacionaba la eficacia sexual con el nivel de heterozigosidad multilocus, contabilizamos el número de individuos apareados y no apareados, de cada sexo, que tenían distintos valores de heterozigosidad (N= número de loci heterocigotos) y mediante un estimador de productos cruzados (W) estimamos la eficacia sexual. De esta forma se pudo determinar si existía una relación significativa entre las dos variables. Ambas hipótesis fueron rechazadas en base a nuestros resultados al no encontrar diferencias entre el parentesco de las parejas y los individuos no apareados circundantes y al obtener una relación no significativa entre la eficacia sexual y el nivel de heterozigosidad multilocus, aunque el resultado en machos es sugerente (p= 0,0778) y apunta a que quizás exista dicha relación. Además, tampoco se observaron diferencias significativas entre el parentesco de parejas homotípicas y el de parejas heterotípicas. Estos resultados no explicarían por qué hay un apareamiento asociativo negativo para el color. En el Capítulo 5 se estudia el sesgo de escala que puede existir para el apareamiento descrito en el Capítulo 2 con el objetivo de averiguar cuál es la escala espacial en la que ocurre la elección de pareja en L. fabalis utilizando el color de la concha. Para esto se llevó a cabo un muestreo en los años 2015 y 2016 en el que además de muestrear las parejas se muestrearon los individuos no apareados alrededor de éstas en cuatro áreas de diámetro distinto (10, 20, 40 y 60 cm). Con estos datos se pudo medir el apareamiento asociativo a distintas escalas. Siguiendo el argumento de Rolán-Alvarez et al. (2015b) calculamos el sesgo de escala utilizando el valor de apareamiento asociativo de cada año y las estimas de apareamiento en las cuatro áreas estudiadas. Se llevaron a cabo diversos modelos de regresión para encontrar el mejor ajuste entre las estimas del sesgo de escala y el diámetro de cada área de muestreo. De éstos, el modelo de regresión inversa proporcionó el mejor ajuste. En base a los resultados obtenidos la elección de pareja parece ocurrir a una escala muy reducida. Como posibles explicaciones se plantea por un lado la baja movilidad de L. fabalis y por otro el aumento de información, por ejemplo, el mayor número de rastros de moco encontrados al recorrer una superficie más extensa. Discriminar entre múltiples rastros podría suponer un coste energético elevado por lo que el macho tendería a seguir los rastros disponibles más próximos y a conformarse con las hembras más cercanas que se adecúen a su preferencia sexual. Esto lleva a pensar que ante una reducción en la densidad poblacional el fenómeno del apareamiento asociativo negativo podría perderse o atenuarse. Esta estrategia se plantea como un método general para estudiar la escala de la preferencia, independientemente del mecanismo de preferencia (visual, táctil, olfativo, etc). Muchos de los datos obtenidos para dar respuesta a las distintas preguntas formuladas (ver final de esta sección), permitieron obtener además resultados que complementaron y dieron más consistencia a las respuestas obtenidas en esta Tesis Doctoral. Por ejemplo, con los datos moleculares del Capítulo 4 se pudo estimar también el censo efectivo, y por ende, la estimación de la deriva genética en la población de Abelleira. Esta estima se llevó a cabo utilizando los caracteres del color y el patrón de bandas de la concha. En ambas estimas se observó que la deriva genética no podría explicar los cambios de frecuencia observados a lo largo de los seis años en ambos caracteres. Los resultados observados para el carácter color podrían no ser suficientemente realistas dado el desconocimiento de la base genética de éste en L. fabalis. Por otra el parte, todas las observaciones del modo de herencia del patrón de bandas señalan que este carácter está basado en un gen bialélico con dominancia completa, por lo que la estima de deriva para este carácter sí es realista. Estas observaciones, complementado las observaciones del Capítulo 2 y el análisis realizado en bandeados recogido en el Anexo 1, dan una mayor consistencia a la observación de una selección sexual negativa dependiente de las frecuencias de color, y de una selección apostática en el patrón de bandas. Por último, para determinar el grado de distribución espacial del color en todos los individuos y en distintos sexos, se tomaron fotografías aéreas de la zona de muestreo. Gracias a puntos en el área de coordenadas conocidas, la fotografía se pudo georreferenciar de tal forma que a las cópulas muestreadas se les pudiese adjudicar coordenadas posteriormente. Los resultados presentados para este análisis tienen valor descriptivo y a priori no indican ningún tipo de distribución de las distintas variables estudiadas. En esta Tesis Doctoral se han abordado distintos aspectos alrededor del hecho de que el polimorfismo de color de la concha de L. fabalis, se ha mantenido estable a lo largo de 26 años. En concreto se han formulado las siguientes preguntas: ¿Existe un mecanismo de selección dependiente de las frecuencias en las poblaciones gallegas de L. fabalis? ¿De qué forma funciona? ¿Cuál es la componente de eficacia más relacionada con el color de la concha? ¿Puede explicar la deriva genética los cambios en frecuencia en los distintos caracteres? Estando el patrón de selección sexual causado por una preferencia negativa, ¿hasta qué punto puede explicar la preferencia dicho patrón variando la herencia genética del carácter? Dada la existencia de una preferencia sexual negativa, ¿cuáles son las causas por las que se da? ¿Es la preferencia negativa durante los apareamientos un mecanismo que evolucionó para reducir la endogamia? ¿A qué escala ocurre la elección de pareja en L. fabalis? ¿Cuál es el sesgo de escala entre toda el área de muestreo y el área de elección de pareja? ¿Existe una diferencia de distribución entre los distintos colores? Algunas de las preguntas se han conseguido responder más que otras y por lo tanto esta Tesis queda abierta a investigaciones futuras. Por ejemplo, dilucidar las causas de la preferencia sexual negativa en la población estudiada; determinar si los resultados obtenidos aquí se dan también en otras poblaciones; determinar la base genética del color de la concha (el avance en las herramientas genómicas y la secuenciación completa de los genomas de Littorina podrían facilitar esta tarea); seguir estudiando los resultados expuestos en este trabajo durante más años; realizar experimentos de depredación para determinar qué agente podría conducir la selección apostática en L. fabalis; determinar mediante qué señal encuentran los machos de L. fabalis a las hembras y cuánta información pueden obtener de ésta; etc.