Estudio evolutivo y funcional del proteoma de gametos de Mytilus edulis y M. galloprovincialis integrando diferentes técnicas -ómicas

Resumo

El concepto biológico de especie para organismos con reproducción sexual define a esta como un grupo de poblaciones que de forma natural se cruzan entre si y están reproductivamente aisladas de otros grupos. La formación de nuevas especies es uno de los temas de estudio centrales en biología evolutiva y se considera un proceso dinámico y continuo, donde actúan diferentes mecanismos de aislamiento reproductivo, tanto antes (precigóticos) como después (postcigóticos) de la formación del cigoto. En especies estrechamente emparentadas, con una historia de divergencia evolutiva reciente, donde el aislamiento reproductivo todavía no es total es posible que se produzca hibridación. Las zonas híbridas resultantes son áreas naturales de especial interés para el estudio de los mecanismos de aislamiento reproductivo, ya que en ellas se puede observar el resultado y consecuencias del cruce de dos especies tanto a nivel genético como fenotípico. Los organismos marinos que se reproducen a través de la liberación de sus gametos al medio y posterior fecundación externa se han utilizado como organismos modelo para el estudio de las adaptaciones y estrategias involucradas en la limitación de los cruces interespecíficos. Se ha descrito en diferentes grupos de individuos que las proteínas candidatas a estar implicadas en el reconocimiento gamético podrían evolucionar rápidamente por selección positiva darwiniana, limitando de este modo el flujo génico entre especies. Por otra parte, los gametos contienen los genes y productos génicos que contribuyen a formar y desarrollar correctamente el cigoto y posteriores etapas embrionarias. Las incompatibilidades entre los genomas que aporta cada gameto así como en su contenido proteico podrían por lo tanto desencadenar combinaciones de genes y productos génicos no funcionales y producir con ello inviabilidad de los descendientes o una reducción de su eficacia biológica, contribuyendo a la integridad de las especies. Es por ello que los gametos son el tipo celular clave para el estudio de mecanismos de aislamiento reproductivo, y concretamente estos estudios deben dirigirse sobre sus proteínas ya que representan el fenotipo molecular sobre el que la selección natural actúa directamente. Con la llegada de las técnicas –ómicas es posible analizar una gran cantidad de genes y proteínas de forma global, permitiendo reducir la distancia existente entre el conocimiento de los fenotipos reproductivos y sus mecanismos moleculares subyacentes. En este trabajo se estudió principalmente el proteoma de los gametos de dos especies de mejillón con fecundación externa y evolutivamente muy próximas entre sí, Mytilus edulis y M. galloprovincialis, provenientes de poblaciones alopátricas (Swansea y Vigo) y una población donde ambas especies viven e hibridan de forma natural (Croyde). Este estudio se complementó con diferentes aproximaciones –ómicas para un correcto análisis e interpretación conjunta de los resultados. En primer lugar, se realizó un estudio mediante la secuenciación profunda (RNA-seq) del transcriptoma de tejido gónadal maduro indiferenciado del manto de mejillón macho de ambas especies de las poblaciones alopátricas tras una aclimatación en condiciones de laboratorio comunes controladas. Para determinar el sexo y minimizar el efecto debido a las diferencias de estadio de madurez se realizó un estudio histológico de la gónada de los mejillones analizados. Los resultados de este trabajo han contribuido a, 1) la obtención de un transcriptoma consenso específico de tejido y especie para mejorar cuantitativa y cualitativamente las identificaciones proteicas de los posteriores experimentos, y 2) proporcionar una lista preliminar de tránscritos candidatos a estar implicados en mecanismos de aislamiento reproductivo en base a la expresión diferencial que mostraron entre ambas especies y la implicación funcional directa del producto génico en la biología del espermatozoide y fecundación. Los mejillones de las especies M. edulis y M. galloprovincialis se caracterizan por presentar diferencias fenotípicas y genéticas sutiles que dificulta su clasificación en las respectivas especies. Además ambas especies hibridan en zonas de contacto secundario lo que conlleva que la realización de esta clasificación a nivel individual sea aún más complicada. Dado que en este trabajo se estudiaron individuos que se recogieron en poblaciones naturales, y en una de ellas (Croyde) ambas especies conviven e hibridan de forma natural, la clasificación de los individuos a nivel de especie es imprescindible para poder interpretar correctamente los resultados obtenidos del estudio proteómico de sus gametos. Para ello, se realizó un barrido genómico mediante marcadores AFLPs. Complementariamente se estudiaron los genotipos obtenidos a partir de la amplificación por PCR del marcador molecular Glu-5’ y los resultados del análisis de una serie de caracteres morfométricos de la concha y morfológicos relacionados con la coloración, utilizados clásicamente en diferentes trabajos relacionados con estas dos especies de mejillón. Mediante el estudio de estos marcadores genéticos y morfológicos se ha conseguido, 1) comparar y determinar qué marcadores presentan mayor poder discriminante entre ambas especies de mejillón, 2) obtener una visión global de la composición genética y nivel de hibridación presente en los individuos que liberaron sus gametos y posteriormente se analizaron en el estudio de proteómica, y 3) detectar la presencia de mayor éxito reproductivo en los mejillones de la especie M. galloprovincialis de la Croyde con respecto a híbridos y mejillones de la especie M. edulis. El principal foco de atención del trabajo realizado en el marco de esta tesis doctoral se dirigió hacia el estudio comparativo del proteoma de gametos de ambas especies mediante electroforesis bidimensional y posterior identificación proteica mediante espectrometría de masas. Los resultados generales de este trabajo han contribuido a, 1) la obtención del primer estudio comparativo del proteoma de espermatozoides y ovocitos de mejillones de las especies M. edulis y M. galloprovincialis de poblaciones alopátricas, 2) la identificación de más de un centenar de proteínas candidatas a estar involucradas en el aislamiento reproductivo mediante el uso de diferentes bases de datos, 3) detección de asociación significativa entre las proteínas mitocondriales y citosólicas de ambos tipos de gametos con el grupo de proteínas que mostraron sobreexpresión en las especies M. edulis y M. galloprovincialis, respectivamenteentre, al igual que las proteínas relacionadas con la proteólisis mostraron una asociación significativa con el grupo de proteínas sobreexpresadas en la especie M. galloprovincialis en ambos tipos de gametos, mientras que las relacionadas con el ciclo del ácido tricarboxílico y con funciones antioxidantes lo hacen con aquellas que mostraron sobreexpresión en la especie M. edulis en espermatozoides, 4) evidenciar un elevado grado de fosforilación, hasta un 57,5% del total de spots estudiados del proteoma de espermatozoides, 5) proporcionar evidencias compatibles con la hipótesis de permeabilidad génica con intensidad de flujo asimétrico, desde la especie M. edulis hacia la especie M. galloprovincialis, en gametos de los mejillones analizados de la población de Croyde, 6) detectar un aumento del nivel de diferenciación en el proteoma de espermatozoides de la especie M. galloprovincialis en comparación con el proteoma de ovocitos de la población de Croyde que sugiere la presencia de fuerzas selectivas diferentes sobre cada tipo de gameto, compatible con la presencia de fenómenos de reforzamiento asimétrico entre la especies M. edulis y M. galloprovincialis en esta población híbrida, un escenario plausible teniendo en cuenta el modo inusual de herencia uniparental doble (DUI) del ADNmt que presentan los mejillones del género Mytilus, y 7) constatar una elevada congruencia entre la dirección de expresión de los spots proteicos que mostraron diferencias significativas entre ambas especies del proteoma de espermatozoides y los correspondientes loci que mostraron expresión diferencial a nivel de transcriptoma de tejido gonadal maduro indiferenciado del manto de mejillón macho. Como resultado general es importante destacar que el conjunto de trabajos que componen esta tesis doctoral contribuye a avanzar en el conocimiento sobre los mecanismos de aislamiento reproductivo de dos especies de mejillón estrechamente emparentadas, Mytilus edulis y M. galloprovincialis, y lo hace desde el estudio conjunto y uso complementario de diferentes técnicas ómicas. Es por ello que se puede concluir que a nivel del proteoma se encontró una elevada diferenciación en los gametos de las poblaciones alopátricas, compatible con la presencia de evolución rápida bajo selección positiva y con la presencia de mecanismos de aislamiento reproductivo operando entre las dos especies. La diferenciación se mantiene en la población simpátrica de Croyde, pero el incremento de diferenciación detectado en espermatozoides de la especie M. galloprovincialis con respecto a los ovocitos de la misma especie evidencia la presencia de mecanismos evolutivos diferentes a los encontrados en las poblaciones alopátricas.