Extracción de lipasas de termófilos y halófilos mediante líquidos iónicos

Resumo

El éxito de la industria biotecnológica radica en la diversificación de su actividad en numerosos sectores de mercado tales como el farmacéutico, el cosmético, el sanitario, el químico, el agroalimentario y el medioambiental, entre otros. De este modo, se está logrando una sustitución paulatina de ciertos procesos químicos por alternativas biológicas, utilizando biocatalizadores (enzimas y/o microorganismos). En este escenario, las lipasas (triacilglicerol hidrolasas, EC 3.1.1.3) destacan por su capacidad para actuar en múltiples reacciones químicas tanto en medios acuosos (hidrólisis) como en medios orgánicos (esterificación, interesterificación o transesterificaión, entre otras), pudiendo biocatalizar numerosas aplicaciones industriales relacionadas con la resolución de mezclas racémicas, la síntesis de nuevos compuestos cosméticos y farmacológicos, así como la bioconversión de aceites y grasas con aplicación en detergentes, alimentos y biocombustibles. A menudo, los procesos industriales se desarrollan en condiciones desfavorables para las enzimas. Las temperaturas y presiones altas así como la elevada concentración de disolventes modifica el estado nativo de la enzima reduciendo o incluso eliminando su activad catalítica. Una posible solución a este problema es el empleo de enzimas procedentes de organismos extremófilos, que son aquellos que colonizan hábitats considerados extremos desde un punto de vista antropogénico (fuentes termales, desiertos, fosas abisales, volcanes, salinas, etc.) y cuyos metabolismos están adaptados a condiciones extremas. Normalmente, la producción de enzimas a partir de microrganismos supone elevados rendimientos gracias a algunas ventajas técnicas como la facilidad de optimizar el medio de cultivo y las condiciones operacionales, así como la posibilidad de mejorar el proceso de producción mediante modificación genética. Sin embargo, a menudo la implementación del proceso a escala industrial se ve dificultada por los elevados costes asociados a las etapas de downstream. Así, el hecho de que muchas enzimas sean intracelulares conlleva mayores costes debidos a la necesidad de etapas de disrupción celular y purificación. Dentro de este contexto, esta Tesis Doctoral tiene como objetivo principal la búsqueda de procesos de producción de lipasas más eficientes y medioambientalmente sostenibles. Para ello, se propone la utilización de los líquidos iónicos como alternativa a los disolventes orgánicos volátiles convencionales empleados en la extracción de enzimas. Para ello, se apostará por su empleo en Sistemas Acuosos Bifásicos (ABS, del inglés, Aqueous Biphasic Systems) ya que, a priori, se puede pensar que la naturaleza acuosa de las fases es más biocompatible con los caldos de cultivo donde se sintetizan las enzimas. A pesar del carácter iónico y orgánico-inorgánico de los líquidos iónicos, que hace atractivo su uso en procesos de extracción y/o biocatálisis, existen diversos trabajos de investigación que hacen referencia al efecto desactivante de los líquidos iónicos hidrofílicos sobre las lipasas comerciales. En base a esta premisa, se plantea la hipótesis de partida de este trabajo, al considerar a los microorganismos halófilos como fuente de enzimas capaces de operar bajo estrés salino, de modo que mantengan su actividad en presencia de líquidos iónicos. Por otra parte, también se ha apostado por los microorganismos termófilos debido a su demostrada robustez al ser empleados en presencia de diversos disolventes orgánicos. En ese sentido, los seis objetivos específicos de esta Tesis Doctoral se muestran a continuación: I. Desarrollo de un proceso biológico de producción de enzimas lipolíticas a partir de microorganismos halófilos. Debido a la práctica ausencia de lipasas comerciales con origen halofílico, se contemplan las etapas principales para sintetizar eficazmente el biocatalizador mediante cultivo microbiano: screening en placa, optimización del medio de cultivo y de las condiciones operacionales (temperatura, pH) así como el escalado del proceso desde matraz a biorreactor de laboratorio. II. Generación de una librería de líquidos iónicos. Síntesis y purificación de líquidos iónicos de nueva generación, formados por el catión colina combinado con aminoácidos y dipéptidos. Se realizarán los análisis necesarios (análisis de Resonancia Magnética Nuclear y Espectroscopia de Transmisión de Infrarrojo con Transformada de Fourier) para verificar su estructura y se llevará a cabo la caracterización físico-química de los líquidos iónicos sintetizados. III. Análisis del efecto de los líquidos iónicos en la actividad de las enzimas extremófilas. Evaluación de la actividad lipolítica de los crudos enzimáticos obtenidos a partir de microorganismos termófilos y halófilos en disoluciones acuosas de diferentes líquidos iónicos. IV. Caracterización termodinámica de los ABS. Una vez demostrada la capacidad salting-out de los líquidos iónicos de interés, se abordará la caracterización termodinámica de la región bifásica existente. V. Implementación del sistema de separación y purificación de enzimas lipolíticas mediante líquidos iónicos. Aplicación de líquidos iónicos seleccionados según el análisis previo de biocompatibilidad para la extracción de las lipasas producidas por halófilos y termófilos, comparándose su estabilidad con una lipasa comercial. VI. Modelado de datos experimentales. Se aplicarán diferentes modelos matemáticos a los datos experimentales de producción enzimática y crecimiento obtenidos a distintas escalas, y se caracterizarán los sistemas de separación (curvas binodales y rectas de reparto) mediante modelos empíricos. Para llevar a cabo el trabajo de investigación requerido para alcanzar todos estos objetivos se ha contado con la colaboración de los grupos Bioingeniería y Procesos Sostenibles (BIOSUV) y Procesos de Separación Avanzada (PROSEPAV) del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Vigo. Todos los estudios de la presente Tesis Doctoral han sido realizados bajo la supervisión de la Prof. Dra. Mª. Ángeles Sanromán Braga, del Prof. Dr. Fº. Javier Deive Herva y de la Prof. Dra. Ana Mª. Rodríguez Rodríguez de la Universidad de Vigo. Los resultados obtenidos han sido publicados o enviados para su publicación en seis artículos científicos, motivo por el cual esta Tesis se presenta por compendio de artículos. A continuación, se detalla un breve resumen en el que se exponen los resultados más destacables. En una primera etapa, los esfuerzos han sido orientados hacia la búsqueda de nuevos microorganismos extremófilos con altos niveles de actividad lipolítica, apostándose principalmente por cepas halófilas de ambientes marinos y fuentes termales. En concreto, se aislaron microorganismos a partir de muestras de las salinas del Parque Natural de Torrevieja y la Mata, España, y de las fuentes termales de Pamukkale, Turquía. Después de un screening inicial en placas de agar con tributirina o aceite de oliva y rodamina B mediante la formación de halos transparentes o anaranjados alrededor de las colonias, se aislaron tres cepas con capacidad de crecimiento y producción de enzimas lipolíticas a concentraciones de elevadas de NaCl (superiores al 15 %). Se cultivaron los tres aislados en medio líquido específico para el crecimiento de halófilos y tras evaluar cuantitativamente la actividad lipolítica de los diferentes cultivos, se seleccionó la cepa identificada como Halomonas sp. LM1C como candidata prometedora para ser cultivada a escala biorreactor de laboratorio, ya que mostraba niveles de actividad lipolítca superiores a las otras dos cepas. Para ello, se procedió a optimizar el proceso de producción de lipasas, determinándose la temperaturas y el pH óptimos tanto del cultivo como de la enzima sintetizada mediante el empleo de la Metodología de Superficie de Respuesta basada en un diseño compuesto centrado en las caras, que dio lugar a niveles de producción de enzimas lipolíticas superiores a 200 U/L. A continuación, se comprobó la viabilidad del uso de la inducción biológica como alternativa a química tradicional, logrando valores de actividad de alrededor de 3000 U/L. Gracias al análisis mediante Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas se pudo concluir que el efecto inductor se debía a la existencia de formas isométricas del ácido pentadecanoico presente tanto en las células como en el sobrenadante del cultivo de Staphylococcus equorum AMC7. Estos niveles fueron próximos a los alcanzados mediante inducción química del surfactante no iónico comercial, Tritón X-100®. Para concluir con esta etapa, se realizó el escalado en biorreactor de laboratorio. De las configuraciones estudiadas, se concluyó una mayor eficacia del tanque con agitación mecánica con un volumen de trabajo de 1,5 L ya que permitió obtener resultados de biosíntesis enzimática más semejantes a los alcanzados a menor escala. Se modelaron todos los datos experimentales del proceso en condiciones óptimas mediante ecuaciones logísticas, y se empleó el modelo de Luedeking & Piret para dilucidar las características metabólicas de las enzimas sintetizadas tanto a escala matraz como en biorreactor. Estas investigaciones permiten sentar las bases de un proceso biotecnológico para producir enzimas lipolíticas capaces de llevar a cabo su acción biocatalítica en condiciones extremas de sal. La primera parte de este trabajo fue publicada en la revista Biochemical Engineering Journal (Gutiérrez-Arnillas, E.; Rodríguez, A.; Sanromán, M.A.; Deive, F.J. (2016). New sources of halophilic lipases: Isolation of bacteria from Spanish and Turkish saltworks. Biochemical Engineering Journal 109, 170-177). Además, dada la relevancia de los niveles de producción alcanzados con un microorganismo halófilo, el estudio del proceso de inducción biológica y el escalado a biorreactor ha sido patentado por medio de la Universidad de Vigo. (Oficina Española de Patentes y Marcas, número de solicitud: P201700078). Después de obtener el registro de la patente, el trabajo fue enviado a la revista Bioresource Technology, obteniendo su aceptación en abril de 2017 (Gutiérrez-Arnillas, E: Arellano, M.; Deive, F.J.; Rodríguez, A.; Sanromán, M.A. (2017). Unravelling the suitability of biological induction for halophilic lipase production by Halomonas sp. LM1C cultures. Bioresource Technology 239, 368-377). A continuación, y en el marco de los objetivos planteados en la presente Tesis, se procedió a estudiar el papel de líquidos iónicos comerciales y de nueva síntesis como posibles disolventes de extracción de enzimas lipolíticas para la etapa de downstream. En concreto, se centró el trabajo en los ABS debido a sus excelentes propiedades para separar metabolitos de interés industrial. En primer lugar, se demostró el potencial de diferentes líquidos iónicos de la familia imidazolio para ejercer un efecto lítico sobre la pared celular de la cepa Thermus thermophilus HB27, y liberar así al medio gran parte de las enzimas lipolíticas intracelulares y ligadas a la membrana. El estudio realizado reveló que la longitud de la cadena alquílica era determinante para lograr una interacción efectiva entre el líquido iónico y la membrana celular, de modo que la adición de cloruro de 1-decil-3-metilimidazolio en cultivos de Thermus provocó que los niveles de actividad extracelular aumentasen en detrimento tanto de la actividad intercelular como la determinada en la membrana. Las imágenes de Microscopia Electrónica de Transmisión y de Barrido permitieron observar la existencia de daños celulares, lo que permite concluir el efecto lítico del líquido iónico. Por otra parte, se empleó este líquido iónico para llevar a cabo la extracción mediante un ABS conseguido gracias a la presencia de una sal inorgánica. Se evaluó el papel de diferentes sales, tanto inorgánicas como orgánicas, para producir la segregación de fases, obteniendo varios sistemas bifásicos que permitieron hacer un análisis de las regiones de inmiscibilidad en función de las propiedades termodinámicas de dichas sales. El sistema basado en carbonato sódico presentó una mayor región bifásica, por lo que se seleccionó para llevar a cabo la extracción. Sin embargo, a pesar de que en un estudio preliminar esta sal no mostraba efectos negativos en la actividad de la termoenzima, la mezcla con el líquido iónico conllevó una pérdida significativa del potencial biocatalítico. En este contexto, se apostó por llevar a cabo la extracción con sulfato de amonio como agente segregante, dando lugar a porcentajes de extracción del 96%. En esta parte de la Tesis, se demuestra la viabilidad de una estrategia integrada que combina una primera etapa de lisis celular mediante adición de un líquido iónico al cultivo que, cuyo papel será clave en una segunda etapa para facilitar la extracción de las enzimas lipolíticas. Este trabajo ha dado lugar a la publicación de dos artículos: En el primero de ellos, se analiza el potencial segregante de diferentes sales (Torres-Plasencia, G.; Gutiérrez-Arnillas, E.; Deive, F.J.; Sanromán, M.A.; Rodríguez, A. (2015). Triggering phase disengagement of 1-alkyl-3-methylimidazolium chloride ionic liquids by using inorganic and organic salts. Journal Chemical Thermodynamics 88, 1-7). En el segundo artículo se demuestra el efecto lítico de los líquidos iónicos basados en el catión imidazolio sobre las células del microroganismo termófilo T. thermohilus HB27, así como su capacidad extractiva en la separación de enzimas lipolíticas del caldo de cultivo (Gutiérrez-Arnillas, E.; Deive, F.J.; Sanromán, M.A.; Rodríguez, A. (2015). Ionic liquid for the concomitant use in extremophiles lysis and extremozymes extraction. Bioresource Technology 186, 03-308). Durante la siguiente etapa de la Tesis, se abordó la síntesis de nuevos líquidos iónicos en los que se combinó el catión colina con aniones de dipéptidos, en busca de lograr disolventes más biocompatibles y medioambientalmente sostenibles. Para realizar esta tarea, se contó con la colaboración del Prof. Ohno en el laboratorio Ohno & Nakamura Laboratory (TUAT, Japón). Una vez demostrada la viabilidad de la síntesis, se escaló su producción para asegurar su disponibilidad en el estudio de la actividad enzimática de tres lipasas de diferente procedencia: una comercial de Candida rugosa, una termófila producida en el laboratorio mediante la cepa T. thermophilus HB27 y una lipasa halófila secretada por la cepa Halomonas sp.LM1C, previamente aislada. Se evaluó la actividad catalítica de las enzimas en función de parámetros importantes como la polaridad o la hidrofobicidad de los líquidos iónicos sintetizados y se incluyeron diversos líquidos iónicos comerciales a efectos comparativos. En general, se apreció que la lipasa termófila mantenía su actividad catalítica por encima del 70% en todos los disolventes, llegando a alcanzar valores superiores al 100% en algunas disoluciones acuosas. Además, se concluye la idoneidad de las lipasas extremófilas, al ser comparada su capacidad biocatalítica con la comercial, ya que esta última se desactivó en presencia de todos los líquidos iónicos evaluados. Análogamente, se confirmó la hipótesis de partida de la Tesis, en la que se planteaba que los líquidos iónicos formados por colina y aminoácidos o dipéptidos permitían mayores niveles de actividad enzimática que los comerciales derivados del catión imidazolio. En la última etapa de la Tesis, se evaluó la capacidad de extracción de las tres lipasas consideradas mediante ABS formados por líquidos iónicos basados en el catión colina y los aniones cloruro, glicinato y glicilglicinato. Se seleccionaron estos aniones debido a las ventajas de bioactividad concluidas anteriormente. Por otra parte, se comprobó que uno de los compuestos responsables de un gran efecto inductor de la actividad lipolítica durante la producción de lipasas halófilas (el Tritón X-100®) permitía obtener ventanas de inmiscibilidad en la presencia de los tres líquidos iónicos seleccionados, por lo que se determinó la región de inmiscibilidad de estos sistemas. Para llevar a cabo este trabajo se realizó una estancia de investigación en la Universidade Nova de Lisboa, bajo la supervisión del Prof. Rebelo. A continuación, se determinó la eficacia de extracción así como el efecto de la composición de la alimentación en una misma recta de reparto sobre la partición de las enzimas en el sistema bifásico. Los datos obtenidos del proceso de separación de la lipasa comercial revelaron una mayor afinidad de la lipasa por la fase rica en líquido iónico, alcanzando valores superiores al 85% de extracción de proteína. Sin embargo la desactivación total de la lipasa comercial durante el proceso de extracción, puso de relieve la necesidad de enzimas que mantuviesen la actividad biocatalitica durante el proceso de separación mediante ABS. De modo que, el análisis de la capacidad de extracción para las lipasas de microrganismos halófilos y termófilos confirmó que la proteína se segregaba preferencialmente a la fase más hidrofílica, al igual que su homóloga comercial, pero se evitaba la drástica desactivación enzimática detectada en la comercial. Además, la cuantificación de la actividad lipolítica en ambas fases permitió evaluar la capacidad del sistema para purificar las enzimas lipolíticas, concluyendo que la selección del punto de extracción a lo largo de la recta de reparto era crucial para modificar los patrones de distribución de la proteína total en ambas fases lo que causaba la purificación de la lipasa, ya que la actividad lipolítica únicamente se detectada en la fase de colina. De este estudio se puede concluir que los líquidos iónicos basados en colina pueden actuar de manera conjunta como agentes de extracción y como medios de reacciones biocatalíticas. Sobre esta premisa, se abordó una búsqueda bibliográfica centrada en la situación actual del desarrollo de la producción de biodiesel mediante lipasas y disolventes de diseño, como demuestra el artículo de revisión ya publicado (Gutiérrez-Arnillas, E.; Álvarez, M.S.; Rodríguez, A. Deive,; F.J. Sanromán M.Á. (2016). New horizons in the enzymatic production of biodiesel using neoteric solvents. Renewable Energy, 98, 92-100. Artículo no incluido en esta Tesis) y que sienta las bases de una nueva línea de investigación del grupo. Por último, y en base al interés de los resultados obtenidos con el estudio de biocompatiblidad de las tres lipasas y el análisis de la extracción mediante ABS con nuevos disolventes de diseño, se han elaborado dos artículos científicos. El primero ha sido enviado a la revista Green Chemistry (Gutiérrez Arnillas, E.; Ichikawa, T.; Sanromán, M.A.; Rodríguez, A.; Ohno, H.; Deive, F.J. (2018). Extremolipases and cholimiun peptide ionic liquids: in search of a perfect match. Green Chemistry) y el segundo está a la espera de ser aceptado por la revista Separation and Purification Technology (Gutiérrez Arnillas, E.; Sanromán, M.A.; Rodríguez, A.; Deive, F.J. (2018). On the role of cholinium glycinate for the separation of extremophilic lipolytic biocatalysts. Separation and Purification Technology). En definitiva, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han permito concluir la viabilidad de la extracción de enzimas lipolíticas de diferente naturaleza mediante la formación de ABS basados en líquidos iónicos biocompatibles. Así, las enzimas producidas por microrganismos extremófilos han mostrado una mayor resistencia durante el proceso de extracción, manteniendo su actividad biocatalítica. Además, los líquidos iónicos basados en el catión colina se presentan como una alternativa medioambientalmente sostenible a los líquidos iónicos comerciales basados en el catión imidazolio en la formación de ABS. Las estrategias de extracción propuestas en esta Tesis podrían ser empleadas en procesos de producción enzimática mejorando la fase de downstream y contribuyendo así al desarrollo de nuevos procesos más sostenibles desde un punto de vista medioambiental. A la vez, tras la puesta a punto de un proceso biotecnológico para la producción de lipasas mediante una nueva cepa halófila, se ha verificado la idoneidad de las enzimas producidas por este tipo de microorganismos para operar en reacciones con disolventes de diseño. ercera generación basados en el catión amonio.