Recubrimientos biomiméticos y bioactivos. Procesamiento y estudio de su biocompatibilidad in vitro

Resumo

En la actualidad, el campo de los biomateriales se encuentra en continua investigación en múltiples áreas clínicas, con el fin de lograr desarrollos avanzados y personalizados dirigidos a aplicaciones específicas. Dentro de su campo de aplicación destacan, especialmente, aquellas áreas relacionadas con el tejido óseo y, en concreto, con la mejora de los implantes actuales. Así, mediante la incorporación de propiedades avanzadas a través de modificaciones físicas o químicas, basadas en el estudio del metabolismo óseo, se pretende incrementar la integración del implante con el hueso circundante y, en definitiva, promover una mayor funcionalidad e interacción con el organismo. Con el mismo fin, pero desde una perspectiva diferente, se investiga también en el diseño de andamios porosos tridimensionales que simulen la matriz extracelular jerarquizada e interconectada del tejido óseo, de forma que se favorezca la migración celular, vascularización y difusión de nutrientes. En ambos casos se trata de una estrategia biomimética y/o bioinspirada, la cual pretende imitar compuestos, estructuras y procesos ya diseñados y perfeccionados por la naturaleza a lo largo de millones de años, para ser utilizados como modelos y/o recursos en el diseño y fabricación de biomateriales más avanzados. Es en este contexto en el que se enmarca el objetivo principal de este trabajo de investigación basado en el desarrollo de recubrimientos de fosfato cálcico avanzados a partir de dos estrategias específicas. La primera de ellas, se basa en la funcionalización de la superficie de biomateriales tradicionales de naturaleza metálica (titanio o acero) mediante la incorporación de recubrimientos de fosfato de calcio enriquecidos con elementos minoritarios (Sr, Si y Se) que presentan un papel relevante en el metabolismo óseo. Esta incorporación se realizará mediante la técnica de láser pulsado (PLD). La segunda estrategia se enmarca en la moderna ingeniería de tejidos y plantea la generación de recubrimientos biomiméticos de fosfato de calcio, a partir de fluidos corporales simulados o soluciones similares sobre andamios porosos obtenidos de recursos naturales o nanoestructuras. En este caso el reto es obtener un recubrimiento de fosfato cálcico distribuido de forma homogénea por toda la superficie de estos andamios tridimensionales o nanoestructuras de morfologías complejas, de forma que promueva la estimulación de las células para la regeneración del tejido óseo. Tras un exhaustivo análisis de los resultados obtenidos se ha podido comprobar la viabilidad de ambas estrategias para la obtención de recubrimientos de fosfato cálcico avanzados, biocompatibles y con propiedades osteogénicas, antibacterianas o antitumorales, según la estrategia específica abordada. En el caso de la incorporación de elementos minoritarios, se fabricaron tres series de recubrimientos utilizando como material de partida hidroxiapatita carbonatada (HAc) comercial mezclada en diferentes proporciones con carbonato de estroncio, tierra de diatomeas y selenio puro, comprobándose una eficiente incorporación de los elementos minoritarios (estroncio, silicio y selenio) y un fino control de la morfología, composición y estructura de los mismos, pudiendo ser ajustados en función de la aplicación final. En concreto se demostró que el estroncio se incorpora como Sr2+ sustituyendo al Ca2+, el silicio en forma de grupos ortosilicato (SiO44-) sustituyendo a los grupos carbonato (CO32-) y el selenio como selenio elemental y selenito (SeO32- ), este último sustituyendo a grupos CO32-. Desde el punto de vista biológico, los recubrimientos de las series de Sr y Si, mostraron ausencia de citotoxicidad y la presencia en ellos de Sr y Si en un 2.0 % y 1.6 % at. de Sr y Si, respectivamente, promovió una mayor diferenciación temprana de las células hBMSCs respecto a los recubrimientos control de HAc pura tras 28 días de incubación. Por otro lado, los recubrimientos con selenio, no presentaron citotoxicidad y la presencia del 0.6-2.7 % at. de Se promovió una adecuada proliferación de la línea celular sana (MC3T3-E1) acompañado de una contención en la proliferación de la línea celular de osteosarcoma humano (MG-63), cuando la cantidad de selenio alcanza el 2.7 % at. Asimismo destacar que este mismo porcentaje de selenio inhibió la capacidad de formar biofilm en las cepas bacterianas estudiadas, S. aureus y S. epidermidis. En relación a los procesos de biomineralización llevados a cabo en nanoestructuras y andamios porosos, se comprobó que el fluido DPBS permite obtener recubrimientos de fosfato de calcio más cristalinos y en tiempos de incubación inferiores a los que se obtienen con el fluido 1.5SBF. En concreto la biocompatibilidad de los nanotubos de carbono oxidados (CNTs) mejoró tras el proceso de biomineralización y, en el caso de los andamiajes de carbón y de carburo de silicio, los recubrimientos generados se adaptaron a los macro y microcanales, preservando el patrón innato del andamiaje poroso tridimensional obtenido de J. maritimus. Finalmente se demostró la ausencia de citotoxicidad y la influencia del patrón del andamiaje (macro y microcanales), tanto del carbón como del carburo de silicio, para promover el crecimiento de pre-osteoblastos MC3T3-E1 de forma orientada. La presente tesis doctoral está estructurada en cuatro capítulos. En el primero de ellos, se aborda el estado del arte de los biomateriales cerámicos, haciendo especial hincapié en la aproximación hacia biomateriales avanzados. En el segundo capítulo se recogen los materiales y métodos empleados para la producción de los diferentes recubrimientos, andamiajes porosos y nanoestructuras utilizadas, así como los protocolos experimentales que se siguieron en los distintos ensayos celulares in vitro. Los resultados más destacados obtenidos de la caracterización físico-química y biológica de los biomateriales producidos por ambas estrategias, se presentan en el tercer capítulo. A continuación se resumen las conclusiones más relevantes que se desprenden de la discusión del capítulo anterior. Finalmente, en el anexo de esta tesis se recogen los equipos y fundamentos de las distintas técnicas fisicoquímicas empleadas en la caracterización de los recubrimientos. La elaboración de esta tesis doctoral ha sido posible gracias a la financiación obtenida del Programa POCTEP: 0330_IBEROMARE_1_P, Ministerio de Ciencia e Innovación MAT2010_18281, MARMED-2011-1/164 y de la Xunta de Galicia GRC2013/008. Las publicaciones asociadas a esta tesis doctoral son las siguientes: Rodríguez-Valencia C., Rial L., Serra J., González P., Rodíguez-González J. B., Mateo-Mateo C. and Correa-Duarte M. A., Tuning the Biomineralization Process for Controll n th Nu l t on n Or nt Growth of C −P Cryst ls onto Fun t on l z Carbon Nanotubes. The Journal of Physical Chemistry, 2012, 116, 3400-04  Pereiro I., Rodriguez-Valencia C., Serra C., Solla E.L., Serra J., Gonzalez P., Pulsed laser deposition of strontium-substituted hydroxyapatite coatings, Applied Surface Science, 2012, 258, 9192-97  Rodríguez-Valencia C., López-Álvarez M., Cochón-Cores B., Pereiro I., Serra J., González P., Novel selenium-doped hydroxyapatite coatings for biomedical applications, J Biomed Mater Res Part A, 2012, 101, 853-61  Rodríguez-Valencia C., Pereiro I., Pirraco R. P., López-Álvarez M., Serra J., González P., Marques A. P. and Reis R. L., Human mesenchymal stem cells response to multi-doped silicon-strontium calcium phosphate coatings, Journal of Biomaterials Applications, 2013, 28, 1397-407  Rodríguez-Valencia C., López-Álvarez M., Stefanov S., Chiussi S., Serra J., González Bio-mineralization of marine patterned C-scaffolds: Physicochemical characterization and preliminary biological evaluation, Bioinspired, Biomimetic and Nanobiomaterials, 2014, 3, 106-114 Además se han presentado en congresos las siguientes comunicaciones:  50 Congreso Sociedad Española Cerámica y Vidrio, Recubrimientos biocerámicos de hidroxiapatita multisustituída por ablación láser, 27-29 de Octubre de 2010, Madrid, España.  VI International Materiais Symposium, Multisubstituted Hydroxyapatite coatings by laser abltion. Characterization and cell-induced behavior, 18-20 de Abril de 2011, Guimarães, Portugal.  IV Congresso Luso-Espanhol de Cerâmica e Vidro, Biocompatibilidad in vitro de células madre mesenquimales sobre recubrimientos biocerámicos de HA-Sr, Si, 16-18 de Noviembre de 2011, Aveiro, Portugal.  Materials in Medicine International Conference, MiMe, Bio-mineralization of marine patterned C-scaffolds: Physicochemical characterization and biological evaluation, 8-11 de Octubre de 2013, Faenza, Italia.  II Edición Investigación Biomédica del cáncer en Galicia. Implantes metálicos recubiertos con selenio-CaP para prevenir la proliferación de osteoblastos cancerígenos, 7 de Mayo de 2015, A Coruña, España.