Expresión del antígeno alfa(2,6)sialilado cdw75 en el proteoma colorrectal humanoidentificación de proteínas portadoras y estudio de su relación con la progresión del cáncer colorrectal

Resumo

El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tipos de cáncer más habituales y con mayor mortandad asociada, especialmente en las regiones económicamente desarrolladas. Así, en Europa es la neoplasia más frecuente y la segunda que más muertes causa. Por tanto, un diagnóstico temprano y certero sería muy deseable, ya que mejoraría las posibilidades de supervivencia de los pacientes. Sin embargo, los únicos marcadores establecidos de uso clínico para el pronóstico y seguimiento de los pacientes con esta enfermedad, el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el antígeno sialil-Lewis A (CA 19.9), no poseen una sensibilidad ni especificidad satisfactorias y además su valor diagnóstico es cuestionable. La sialilación es una de las más importantes modificaciones de glicosilación que poseen las glicoproteínas, ya que afecta tanto a su estabilidad estructural como a su función. Por otro lado, habida cuenta de que en el cáncer se produce una profunda alteración del patrón de glicosilación de las proteínas, particularmente de la sialilación, esta modificación resulta relevante también desde un punto de vista clínico. El epitopo glucídico sialilado CDw75 [Sia¿(2,6)Galß(1,4)GlcNAc-R], también denominado CD75s, es un determinante antigénico integrante de la porción oligosacarídica de glicoproteínas. Fue descubierto en la membrana de linfocitos, si bien se expresa en otras localizaciones y, en este sentido, es conocida su alteración en el curso del CCR, en el que además sus niveles fluctúan dependiendo del estadio tumoral. La investigación llevada a cabo por nuestro grupo de investigación ha permitido certificar el patrón específico de alteraciones que experimenta este epitopo en la mucosa colorrectal de pacientes con CCR. Así, se ha acreditado que la expresión inmunohistoquímica de CDw75 es mayor en el tejido tumoral que en la mucosa sana y que dicho incremento está asociado con los diferentes estadios de malignización. Se ha constatado asimismo que la actividad de la ST6Gal I (ß-galactosil ¿(2,6)sialiltransferasa; EC 2.4.99.1), la enzima que cataliza la última etapa de la síntesis del epitopo, también está aumentada en tejido colorrectal tumoral con respecto a la mucosa sana. No obstante lo anterior, uno de los últimos estudios del grupo ha encontrado que la expresión inmunohistoquímica del epitopo no presenta potencial pronóstico para la supervivencia a 5 años libre de recidiva. En línea con la trayectoria definida por estos trabajos, nos propusimos dar un paso más abordando el estudio de las proteínas portadoras de CDw75 en el tejido colorrectal de los pacientes con CCR. La identidad de estas proteínas se desconocía y creímos que su elucidación podría posibilitar un mejor conocimiento de la biología molecular del CCR y tal vez escrutar el papel de alguna/s de ellas en la progresión de la enfermedad, con el ánimo siempre de analizar su potencial como marcador tumoral o como posible diana terapéutica. Se contaba, en este sentido, con resultados prometedores que indicaban que en la expresión del epitopo CDw75 podría encontrarse un buen marcador de pronóstico y potencial metastásico en CCR. Por todo lo expuesto, el objetivo inicial de esta tesis consistió en la identificación de las proteínas que portaran el epitopo CDw75 en tejido colorrectal, para lo cual se analizaron biopsias de pacientes diagnosticados de CCR. La estrategia seguida consistió en la separación bidimensional de fracciones proteicas obtenidas a partir de dichas biopsias, mediante tiras de isoelectroenfoque de micorrango de pH en la primera dimensión y geles SDS-PAGE en la segunda. Para cada espécimen de tejido se utilizaron dos geles corridos simultáneamente; uno se tiñó con nitrato de plata para poner de manifiesto la posición de las proteínas y el otro se transfirió a una membrana de PVDF, en la que se llevó a cabo la detección de CDw75 mediante inmunoblot con un anticuerpo monoclonal. A continuación se realizó un análisis de imagen para localizar aquellos spots del gel correspondientes a la señal del epitopo en la membrana. Estos spots fueron posteriormente identificados mediante espectrometría de masas de tipo MALDI-TOF/TOF. Tras la detenida consulta de la literatura y de las bases de datos sobre estructura de las proteínas humanas, su patrón de expresión y modificaciones postraduccionales, determinamos que las proteínas con mayor probabilidad de portar el epitopo CDw75 eran la haptoglobina (Hp) y las queratinas citoesqueléticas 8 y 18 (K8 y K18), si bien este primer estudio también permitió identificar otras proteínas de interés para el CCR y con potencial expresión de CDw75. El siguiente paso fue la caracterización de la expresión de Hp, K8 y K18 en tejido colorrectal sano y tumoral, además del análisis de su relación con el CDw75 y con el desarrollo del CCR. Se realizaron estudios de inmunohistoquímica, inmunoblot, citometría de flujo e inmunofluorescencia a partir de especímenes de tejido colorrectal y de cultivos de las líneas tumorales de CCR Caco-2 y HT-29. Los resultados obtenidos certificaron la expresión de Hp en el epitelio colorrectal (a priori una proteína de fase aguda, es decir, de síntesis hepática y presencia sérica), aunque solamente se detectó en el tejido tumoral y en una cuarta parte aproximadamente de los casos analizados. De otro lado, se encontró que la expresión de Hp está significativamente asociada con la presencia de metástasis y, en el grupo de pacientes de hasta 78 años, también con la invasión de ganglios linfáticos. Por lo que se refiere a las conocidas proteínas del citoesqueleto K8 y K18, hemos obtenido evidencias de que se también se encuentran en la membrana plasmática de las células tumorales de CCR y de su sobreexpresión en el tejido colorrectal tumoral. El estudio de asociación de la expresión de estas proteínas en el tejido tumoral con las características clínico-patológicas estándar de tumores y pacientes no rindió resultados positivos de asociación para la expresión de K8, pero sí para la de K18 con el tipo de crecimiento tumoral. Además de lo anterior, la expresión detectada de ambas proteínas fue mayor en los tumores polipoides que en los no polipoides, de peor pronóstico que los primeros. El conjunto de resultados de inmunoblot sugiere que la expresión de la K18 de membrana (no así la de K8) aumenta específicamente en la neoplasia colorrectal. Por otra parte, el estudio de M30, un fragmento apoptótico de la K18, hizo posible constatar el aumento de su expresión en el tejido tumoral de CCR. Por último, el estudio del estatus de acetilación de K8 y K18 en relación con la malignización del epitelio colorrectal, permitió poner de manifiesto que esta modificación postraduccional afecta a enzimas y proteínas relacionadas con el metabolismo energético, la transcripción y la traducción. Este estudio se realizó con células Caco-2 en sus estados diferenciado (de similar fenotipo al epitelio sano) e indiferenciado (asimilable al fenotipo del epitelio tumoral), lo que sugiere que la acetilación está alterada en estas células tumorales y por ello muy probablemente sea uno de los procesos coadyuvante en la transformación neoplásica.