Caracterización estructural y funcional de los genes que codifican las quitinasas en lactococcus lactis y bacillus halodurans

Resumo

La quitina es un homopolímero lineal formado por la unión de unidades de N-acetilglucosamina (GlcNAc) mediante enlaces ß-1,4 glucosídicos. Se trata de uno de los polisacáridos más abundantes de la naturaleza. Las enzimas que degradan este polisacárido, las quitinasas, hidrolizan los enlaces ß-1,4 glucosídicos y juegan un papel importante en la descomposición de la quitina y potencialmente en la utilización de ésta como fuente renovable. Recientemente, las enzimas quitinolíticas, así como los derivados de la quitina obtenidos mediante dichas enzimas, están recibiendo una creciente atención debido a su amplio rango de aplicaciones. Entre las principales aplicaciones de las quitinasas destaca la obtención de quitooligosacáridos, glucosamina y GlcNAc, de gran interés para la industria farmacéutica y agroalimentaria. Por otra parte, debido a la presencia de quitina en las paredes de los hongos y el exoesqueleto de los insectos, estas enzimas se han propuesto como biopesticidas alternativos a los compuestos químicos convencionales. La gran variedad de posibles aplicaciones de las quitinasas requiere, igualmente, de una gran diversidad de enzimas con capacidad para actuar en muy distintas condiciones. Es por ello que el conocimiento de la diversidad genética y bioquímica de las quitinasas (ampliamente representada en el mundo microbiano), permitirá disponer de diferentes enzimas robustas y con distintas propiedades adaptadas al amplio y diverso abanico de aplicaciones propuestas para las mismas. Por último, es importante también destacar que el éxito en el uso de estas enzimas dependerá de la posibilidad de poder obtener preparaciones activas a un coste razonable. En este contexto, el objetivo general de este trabajo consiste en el estudio de las características y posible aplicación de las enzimas quitinolíticas producidas por dos cepas bacterianas procedentes de distintos hábitats, las cepas C-125 de Bacillus halodurans y CECT 185 de Lactococcus lactis. Para ello, en primer lugar, se identificó, se clonó y se secuenció el gen chiA de la cepa de Bacillus halodurans C-125. La secuencia tiene 1800 pb y codifica una proteína de 567 aminoácidos con un peso molecular de 63,36 kDa y un pI de 4,52. Esta proteína se ha denominado ChiABhp. El análisis bioinformático de la proteína ChiABhp demostró que posee una estructura modular que incluye un hipotético péptido señal en el extremo amino-terminal, un dominio catalítico que permitió clasificarla en la familia 18 (GH18) de las glicosil hidrolasas, un módulo de unión a quitina y un dominio FNIIID. La secuencia de ChiABhp mostró una elevada identidad con otras quitinasas bacterianas. En segundo lugar, se aisló, se clonó y se secuenció un gen a partir de la cepa de Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 185 que codifica para una quitinasa. La secuencia cuenta con 1500 pb y codifica una proteína de 460 aminoácidos con un peso molecular de 51 KDa y un pI de 5,08. Esta proteína se ha denominado ChiA1Llp. El análisis bioinformático de la secuencia de ChiA1Llp mostró que tiene una identidad del 99% con la secuencia de la quitinasa de la cepa IL1043 de la misma especie, difiriendo de esta en 4 aminoácidos: una alanina (en lugar de valina) en la posición 12, una valina (en lugar de isoleucina) en la posición 149, una treonina (en lugar de serina) en la posición 268 y una glutamina (en lugar de leucina) en la posición 479. Debido a estas diferencias, el gen que codifica esta proteína se ha propuesto como una nueva variante alélica del gen chiA1 de L. lactis, a la que se le ha dado el nombre de chiA1-2. La proteína ChiA1Llp presentó también una estructura modular consistente en un posible péptido señal, un dominio catalítico característico de la familia 18 (GH18) de las glicosilhidrolasas, un módulo de unión al sustrato y un dominio FNIIID. Ambos genes se expresaron en E. coli. La funcionalidad y la actividad quitinasa de las proteínas ChiABhp y ChiA1Llp quedó demostrada por su capacidad para hidrolizar quitina coloidal, quitina cristalina y diferentes sustratos sintéticos en distinto grado. La presencia en el dominio catalítico de ChiABhp de una inserción ¿+ß permitió concluir que se trata de una exoquitinasa. En cambio, la ausencia de dicha inserción ¿+ß en el dominio catalítico de ChiA1Llp permitió clasificarla como una endoquitinasa. La estimación de sus intervalos de acción mostró que son activas en un amplio rango de valores de pH y temperatura, manteniendo una elevada estabilidad en diferentes condiciones subóptimas. Las quitinasas ChiABhp y ChiA1Llp presentaron capacidad para inhibir el crecimiento de hongos, demostrando el estudio de su espectro de actividad que este es específico para cada una de ellas. ChiABhp inhibió el crecimiento del hongo Aspergillus niger, de los fitopatógenos Fusarium oxysporum y Botryotinia fuckeliana y de los dermatofitos Trichophyton mentagrophytes y Microsporum gypseum, mientras que ChiA1Llp inhibió el desarrollo de Aspergillus niger y de los dermatofitos Trichophyton mentagrophytes y Microsporum gypseum pero no de los hongos fitopatógenos probados en este estudio. Esta propiedad las convierte en enzimas que pueden tener interés como potenciales biofungicidas. La comparativa de la expresión de ambas quitinasas, ChiABhp y ChiA1Llp, empleando dos vectores distintos, puso de manifiesto unos niveles de expresión de proteína activa significativamente más altos (el doble para ChiABhp y el triple para ChiA1Llp), cuando se usó el plásmido pGEX-4T-2 (portador del promotor tac) que cuando se utilizaron los plásmidos tipo pET (portadores del promotor T7), permitiendo concluir que un vector de alto número de copias con un promotor más débil da lugar a una producción más elevada de proteína activa que un vector de bajo número de copias portador de un promotor muy fuerte. La optimización de la expresión en E. coli de las proteínas ChiABhp y ChiA1Llp demostró que los niveles de expresión de proteína en su forma activa son dependientes de la densidad celular del cultivo, de la concentración de inductor y del tiempo de inducción, tanto para las cepas recombinantes transformadas con el plásmido pGEX-4T-2 como para las transformadas con los vectores tipo pET, destacando que los niveles óptimos de expresión de proteína activa empleando las cepas transformadas con los vectores pET requirieron densidades celulares más altas y tiempos de inducción más largos que los óptimos estimados para las cepas transformadas con pGEX-4T-2. La expresión óptima de las quitinasas, en forma activa, se consiguió expresando los genes que las codifican desde el plásmido pGEX-4T-2 (portador del promotor tac) y empleando cultivos celulares con una DO600=0,5 inducidos con IPTG durante 1 hora, a una concentración de 0,12 mM para la cepa BLChBh1 (que expresa la quitinasa de B. halodurans) y de 0,25 mM para la cepa BL21ChiA11Ll1 (que expresa la quitinasa de L. lactis).