Desarrollo y validación del método de slot blot para cuantificar las principales toxinas de clostridium perfringens tipo d, clostridium septicum y clostridium novyi tipo b

Résumé

El género Clostridium está representado por más de 160 especies diferentes, de las cuales 14 son patógenas de animales y humanos. Las enfermedades que provocan incluyen diferentes formas de parálisis muscular (C. botulinum y C. tetani), gangrena gaseosa por infección de heridas (C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. sordellii), gangrena gaseosa espontánea (C. septicum), hepatitis necrótica (C. novyi), hemoglubinuria (C. haemolyticum) o enterotoxemias. Todas estas enfermedades pueden resultar fatales a las pocas horas de la aparición de los primeros síntomas, lo que particularmente genera grandes pérdidas económicas en el sector ganadero. Este sector se ha visto fuertemente desarrollado desde hace más de 50 años, principalmente por el incremento de la demanda de carne de consumo y otros productos derivados, como consecuencia del aumento de la población mundial. Por esta razón, las enfermedades clostridiales implican un problema a escala global. Sin embargo, las enfermedades clostridiales son un problema prevenible mediante el uso de las vacunas adecuadas. Asimismo, la industria farmacéutica veterinaria también ha visto un gran crecimiento en los últimos años, principalmente en el sector referido al cuidado de animales de consumo, como es el caso particular de CZ Veterinaria. CZ Veterinaria es una empresa biotecnológica que se dedica al sector veterinario, tanto con productos propios como para terceros. Entre estos productos se encuentran numerosas vacunas formuladas contra diferentes antígenos clostridiales. En este trabajo nos hemos centrado en los siguientes antígenos: la toxina épsilon de C. perfringens tipo D, la toxina alfa de C. septicum y la toxina alfa de C. novyi tipo B. Actualmente, para cuantificar estas toxinas se utilizan los métodos Límite de floculación y Límite de muerte. El primero se utiliza para la toxina épsilon, está internacionalmente reconocido y consiste en la formación de flóculos visibles cuando hay reconocimiento específico de la toxina activa o inactivada por parte del anticuerpo estándar internacional (suministrado por el NIBSC). Para ello se realizan diluciones seriadas con volúmenes variables de la muestra problema y un volumen fijo de la antitoxina. Presenta los inconvenientes de arbitrariedad en el sistema de detección (ojo humano), elevado consumo de reactivos, así como la duración de la prueba (hasta 15 días) y baja especificidad del antisuero comercial. Por otro lado, el Límite de muerte (utilizado para las otras dos toxinas) consiste en la preparación de diluciones seriadas con volumen fijo de la antitoxina estándar internacional suministrada por el NIBSC y volumen variable de la muestra problema, donde se encuentra la toxina a cuantificar. A continuación se inoculan dos ratones por dilución. El Límite de muerte se determina a partir de la dilución que provoca el 50% de muertes. Esta técnica también presenta inconvenientes: primero, utiliza animales de experimentación, segundo, el elevado consumo de reactivos, y tercero, una vez inactivada la toxina, ésta no puede cuantificarse. Por ello, el objetivo principal de este trabajo fue desarrollar una técnica capaz de cuantificar estas tres toxinas, tanto en su estado activo como inactivado, que no requiera animales de experimentación. Para ello, en primer lugar, se analizaron los perfiles proteicos en diferentes etapas del procesado de antígeno de las tres cepas clostridiales a estudio mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. A continuación se identificaron varias proteínas mediante espectrometría de masas, determinando cuáles de ellas correspondían a las toxinas de interés. En el caso de la toxina épsilon de C. perfringens tipo D y la toxina alfa de C. septicum (toxinas que forman poros heptaméricos) se identificó el monómero y varias formas poliméricas resistentes al SDS y al ß-mercaptoetanol. En el caso de la toxina alfa de C. novyi tipo B se identificó el monómero. Posteriormente se procedió a la purificación de las toxinas mediante electroelución. En los tres casos se recuperaron más de 2 mg de las proteínas identificadas como las toxinas de interés, cantidad suficiente para la formulación del inmunógeno con el que se hiperinmunizaron conejos, con el fin de obtener nuestros propios antisueros. Los tres antisueros obtenidos se analizaron mediante Western Blot y los resultados se compararon con los obtenidos con los antisueros estándares internacionales suministrados por el NIBSC, observando que nuestros antisueros son más específicos. Finalmente, se procedió al desarrollo del método de cuantificación basado en la técnica Slot Blot. Con este método hemos comprobado que se puede cuantificar toxina activa e inactivada (toxoide) en diferentes muestras de C. perfringens tipo D y C. novyi tipo B, mientras que la toxina alfa de C. septicum no fue detectable en las muestras donde está inactivada. En este trabajo se presentan los resultados de los primeros pasos que se deben realizar para la validación de un inmunoensayo bioanalítico: especificidad del anticuerpo, determinación del rango y linealidad del estándar, repetibilidad de resultados con diferentes muestras del proceso de producción y estabilidad de estas muestras durante su almacenamiento, en este caso a 4°C. CZ Veterinaria, en colaboración con la Universidad de Vigo está finalizando la validación del método de Slot Blot haciendo las pruebas de precisión intermedia y validación cruzada. Para ello, seguiremos el procedimiento interno de CZ Veterinaria nº PV-BTV8-RD3/01, que sigue las recomendaciones recogidas en la EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Guideline on bioanalytical method validation (21 July 2011). Por otro lado, la experiencia adquirida durante los años en la producción de antígenos clostridiales para su uso en vacunas polivalentes y los resultados de proyectos previos de investigación, le han dado a CZ Veterinaria la oportunidad de poder estudiar mejoras en su proceso de producción. Esto se materializó con el proyecto de I+D+i ¿Nueva vacuna clostridial polivalente utilizando antígenos obtenidos con nuevos procesos de producción¿. Este proyecto se dividió en dos partes fundamentales. La primera parte consistió en estudiar mejoras en el procesado de antígeno de las diferentes cepas clostridiales. Para ello, para cada cepa clostridial se partió del Cultivo Masivo de dos lotes de producción y se procesó con dos protocolos diferentes: el estándar (SOP), registrado en las diferentes vacunas comerciales, en el que primero se inactiva el cultivo, seguido de la purificación del toxoide, y el procesado nuevo o alternativo (NOP) en el que primero se purifican las toxinas y finalmente se inactivan. Para determinar con cuál de las dos formas de procesar antígeno se obtenía un producto mejor, se formularon vacunas monovalentes con los antígenos obtenidos para cada proceso y cada lote, evaluando los resultados en términos de protección mediante el parámetro actividad o potencia en vacuna. La segunda parte del proyecto consistió en desarrollar y validar la técnica de Slot Blot para la cuantificación de las principales toxinas clostridiales. Una vez desarrollada la técnica también se pudieron estudiar ambos procesados de antígeno en función de los parámetros rendimiento del proceso y grado de purificación del producto. Finalmente, tras analizar la actividad de las vacunas monovalentes y el rendimiento y grado de purificación de los procesados de antígeno estándar y nuevo de C. perfringens tipo D y C. novyi tipo B, se puso de manifiesto que el procesado nuevo o alternativo (NOP) es mejor que el actual (SOP).