Incorporación de técnicas de inmunodetección en la monitorización de larvas de mejillón en las aguas costeras gallegas

Resum

El cultivo de mejillón, /Mytilus galloprovincialis/, se inició en Galicia a mediados del siglo pasado con la instalación de las primeras bateas en la Ría de Arousa. Desde entonces, el sector mitilicultor se ha convertido en el más relevante de la acuicultura española, siendo el primer productor europeo y segundo a nivel mundial. El cultivo de mejillón se basa en el engorde de individuos juveniles en cuerdas colgadas de bateas. Estos juveniles son obtenidos a partir de las poblaciones de la zona intermareal o bien a partir de la captación de larvas del plancton mediante cuerdas colectoras. Con el doble fin de realizar una explotación racional de los bancos naturales de semilla de mejillón y de asesorar al sector mejillonero para la colocación de las cuerdas colectoras, en el año 1999 se iniciaron los primeros estudios para el establecimiento de un programa de seguimiento de la abundancia de las larvas de mejillón en la costa gallega. El primer problema que surgió en este programa fue la dificultad en identificar las larvas de mejillón y distinguirlas de las de otras especies de moluscos bivalvos presentes en las muestras de plancton debido a sus similitudes en los primeros estadios. La resolución de este problema se abordó de forma coordinada por los grupos de investigación del Área de Inmunología de la Universidad de Vigo y del Centro de Investigacións Mariñas, con la generación de anticuerpos monoclonales que reconocen de forma específica a las larvas de mejillón. Estos anticuerpos podrían ser utilizados en la monitorización de larvas de mejillón en muestras de plancton y podrían permitir una automatización del proceso de identificación larvaria. Sin embargo, antes de incorporar estos anticuerpos monoclonales al programa de evaluación de las larvas de mejillón, fue necesario modificar algunas fases de este programa, con el fin de hacerlo compatible con el uso de estas nuevas herramientas de identificación inmunológica. Llevar a cabo estas modificaciones fueron los primeros objetivos de esta tesis doctoral: 1) Búsqueda de un método de conservación larvaria compatible con la inmunodetección. 2) Optimización de la separación de las larvas de los moluscos bivalvos de otros componentes del seston. 3) Reducción de los tiempos de incubación de la muestra con los anticuerpos. Una vez realizadas estas modificaciones metodológicas en el programa de evaluación larvaria e incorporada la fase de inmunodetección al mismo, nos planteamos los siguientes otros tres objetivos: 4) Comparación del método de inmunodetección con el método tradicional de identificación morfológica de las larvas. 5) Estudio del efecto del medio de cultivo en la producción de anticuerpos. 6) Evaluación de posibles modos de automatizar el método de inmunodetección. 6.1) Automatización basada en la citometría de flujo, convencional así como del FlowCAM. 6.2) Automatización basada en el uso de esferas magnéticas. La consecución de los objetivos ha permitido determinar que el método de congelación es el método de conservación compatible con la inmunodetección. Asimismo, las larvas pueden ser eficazmente separadas de los demás componentes del seston mediante centrifugación en gradiente de azúcar. Se ha reducido el tiempo del proceso de inmunodetección en poco más de una hora. Todas estas modificaciones han sido validadas mediante un estudio comparativo con la identificación morfológica. Finalmente, en este trabajo se muestra como la citometría convencional no permite una buena detección de las larvas marcadas con los anticuerpos y que el FlowCAM pese a detectar las larvas marcadas no permite un recuento fiable. Se ha logrado separar larvas de mejillón mediante el uso de esferas magnéticas conjugadas con anticuerpo. Gracias a este trabajo, el procedimiento tradicional de identificación larvaria por identificación morfológica ha sido sustituido completamente por la técnica de inmunodetección. Desde 2009, la Fundación CETMAR encargada de la evaluación larvaria, emplea de forma exclusiva los anticuerpos monoclonales y ha incorporado todas las optimizaciones llevadas a cabo en este trabajo de tesis doctoral.