Generación de anticuerpos monoclonales humanos frente a cd69, vla-4 y otros antígenos de diferenciación leucocitaria

Resumo

INTRODUCCIÓN: El uso de los anticuerpos monoclonales en terapia está siendo una realidad, tanto en el campo de la terapia antitumoral como en procesos inflamatorios crónicos como la artritis reumatoide. Sin embargo la mayoría de los anticuerpos aprobados por la FDA (Food and Drug administration) incluyen secuencias de ratón, o bien son quiméricos o humanizados, lo que hace que tengan menor vida media en circulación, y posibilidad de respuesta inmune frente a las proteínas extrañas. Actualmente sólo existen dos anticuerpos totalmente humanos aprobados para su uso terapéutico obtenidos a partir de ratones transgénicos portadores de genes de Igs endógenas (denominados "xenomouse"). OBJETIVO: Uso de ratones portadores de genes de Igs humanas para la obtención de anticuerpos monoclonales que pudieran tener finalidad terapéutica frente a células mieloides y frente a la molécula CD69, una molécula de activación muy temprana. METODOLOGIA: Se inmunizaron con células mieloides (monocitos o con la línea celular humana U937) o con CD69 (bien recombinante o como proteína de fusión transfectada en una línea celular de rata) diversas cepas de ratones "xenomouse" BABk, BAB k,X y LMB1 capaces todos ellos de producir IgM humana, bien con k humana (BABk y LMB1) o con ambas k y X humanas (BAB k,X), y carecen de los genes endógenos para producir las cadenas pesadas u. y k murinas. Los esplenocitos fueron fusionados con células de mieloma con el fin de obtener hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales, y los anticuerpos fueron analizados sobre diversas muestras celulares (de donantes normales, líneas tumorales y células de sangre periférica, médula ósea, o ganglios de pacientes con tumores hematológicos, y líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide), y en diversos tejidos. Se utilizaron diversos métodos como inmunofluorescencia, ELISA, diversos estudios funcionales, activación celular, proliferación, activación de complemento, agregación celular, Western blot, activación de calcio intracelular y secuenciación de DNA. RESULTADOS: Los ratones responden con IgM humana específica, pero también realizan el cambio de clase a IgG endógena específica. Los anticuerpos son capaces de mutar, en especial la cadena ligera, de forma semejante a los de ratones normales.Se obtuvieron varios hibridomas secretores de: a) anticuerpos completamente humanos frente a células mieloides (5 hibridomas) / b) mixtos (cadena pesada humana y ligera de ratón) (154 hibridomas) de los cuales uno de ellos reconoció a la molécula de adhesión celular VLA-4a y c) completamente humanos frente a la molécula CD69 (7 hibridomas). Tres anticuerpos frente a células mieloides fueron específicos de linaje mielo-monocítico y reconocen a leucemias de pacientes y síndromes mielodisplásico. Los otros dos anticuerpos reconocieron otros tejidos extralinfoides, lo que impediría su uso en terapia. De los 154 anticuerpos mixtos, uno de ellos reconoció a la molécula VLA-4, demostrado por inmunoprecipitación de la molécula y comparación con anticuerpo de ratón específico. El anticuerpo anti-CD69 fue comparado con otros anticuerpos murinos anti-CD69 cedidos por el Dr. Sánchez Madrid, demostrando que se comportan de forma semejante, pero que reconocen y matan células de líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide en presencia de complemento de conejo. CONCLUSIÓN: Los anticuerpos generados podrían tener potencial terapéutico para leucemias de tipo mieloide, y para procesos inflamatorios con participación de leucocitos activados expresando las moléculas CD69 y/o VLA-4._