Avances en el desarrollo de tecnicas de electroseparacion para su aplicacion al analisis de biotoxinas marinas

Resumo

La Tesis doctoral se centró en el desarrollo de metodologías analíticas basadas en electroseparación con el fin de ser aplicadas a la determinación de yessotoxinas (YTXs), toxinas producidas de forma natural en el medio marino. Los estudios realizados acerca de la toxicidad de estos compuestos revelan grandes diferencias en función de la vía de administración. No obstante, su capacidad de actuar como interferente en la determinación de toxinas diarreicas cuando esta se lleva a cabo mediante bioensayos con ratones, hace que su determinación resulta indispensable incluso a niveles traza. Es por ello que se requieren metodologías analíticas eficaces y sensibles para llevar a cabo el control de estos componentes tóxicos, habiéndose desarrollado a tal fin varios métodos de análisis, siendo los cromatográficos los más relevantes. La aplicación de la Electroforesis Capilar (EC) como técnica de separación está cobrando cada vez mayor relevancia tal y como demuestran el elevado número de aplicaciones desarrolladas en los últimos años en varios campos de investigación. Esta tendencia se justifica atendiendo a las ventajas ofrecidas por la EC como son su bajo coste operacional, elevada eficacia, rapidez y simplicidad, así como por el hecho de poder llevar a cabo separaciones incluso en aquellos casos en lo que la cantidad disponible de muestre es muy limitada. Estas características resultan muy interesantes a la hora de considerar la EC como alternativa frente a la Cromatografía de Líquido de Alta Eficacia (CLAE), y por ello el objetivo principal de este trabajo ha sido demostrar la aplicabilidad de la EC al análisis de YTXs. Sin embargo, la falta de sensibilidad asociada a la técnica como consecuencia de la escasa cantidad de muestra inyectada en la capilar se encontró inicialmente como una de las mayores limitaciones, y por tanto una parte fundamental del presente trabajo se centra en estudios enfocados a incrementar la sensibilidad de la EC para esta aplicación. Un problema adicional cuando se trabaja con matrices complejas como aquellas en las cuales las toxinas de origen marino se pueden encontrar presentes, hace que el trabamiento previo de la muestra sea crítico, y no siempre permita alcanzar con eficacia los niveles de concentración requeridos. Por este motivo se consideraron técnica de preconcentración ¿on line¿, principalmente basadas en estrategias de empaquetamiento de la muestra o ¿Stacking¿, optimizando cuidadosamente los diferentes parámetros que afectan al proceso. Una vez finalizada la optimización se obtuvo un significativo incremento de la sensibilidad, haciéndola comparable a aquella alcanzada mediante CLAE. Una vez superada la falta de sensibilidad, los esfuerzos se centraron en la mejora de la eficacia de la EC incrementando la selectividad, mediante el estudio de diferentes modos electroforéticos como la Cromatografía Electrocinética Micelas (MEKC). Al igual que en el modo de EC convencional, se procedió a la optimización y evaluación de este modo de operación, y finalmente a su aplicación al análisis de muestras naturalmente contaminadas. Los resultados obtenidos permiten afirmar que la eficacia de la EC para el análisis de YTXs se incrementó considerablemente tras la aplicación de ese modo de operación, especialmente cuando se encuentran presentes en matrices de elevada complejidad. Finalmente, la EC se acopló a la Espectrometría de Masas (M) con fines de confirmación, acoplamiento que resulta especialmente interesante en esta aplicación teniendo en cuenta que la disponibilidad de estándares de las toxinas es limitada y por tanto en la mayoría de los casos la confirmación de los resultados resulta imprescindible. Por ello se procedió a la optimación de los parámetros que afectan a la separación electroforética así como a la detección mediante EM tras lo cual la técnica acoplada se evaluó para aplicación al análisis de muestras naturalmente contaminadas con YTXs. Los resultados mostraron eficacia en el acoplamiento con la EM lo que permitió la confirmación de la presencia de algunos análogos de YTXs. La aplicabilidad de la EC para el análisis de otras toxinas poliéter presentes en el medio marino como las Pectenotoxinas (PTXs) ha sido igualmente demostrada en este trabajo y los resultados de su aplicación son mostrados de forma adicional. Como conclusión general, se puede afirmar que la EC resultó en una buena alternativa a la CLAE para su aplicación al campo d las toxinas de origen marino. Su acoplamiento con la EM ofrece además el potencial de confirmación, estrictamente requerido cuando no se disponen de estándares de los compuestos de estudio.