Candidate immunological and transcriptional biomarkers for the different stages of tuberculosis infection

Resumo

La Tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por el bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Se ha estimado que un cuarto de la población mundial está infectado con Mtb, siendo una de las principales causas de muerte en el mundo a causa de un mismo agente patogénico. A pesar de que los humanos hemos convivido con la infección por Mtb desde tiempos remotos, la falta de una vacuna eficaz y la aparición de cepas multi-resistentes a antibióticos ha impedido que la TB haya sido erradicada. El éxito de las estrategias de prevención frente a la TB depende principalmente de un diagnóstico y tratamiento eficiente de la gente infectada. El tratamiento de gente con infección latente e infección activa ha ayudado a frenar la transmisión de TB, pero lleva asociados varios efectos adversos relacionados con la larga duración y la toxicidad de dichos tratamientos. Una identificación precisa de la gente infectada es por tanto crucial para establecer en régimen de tratamiento más adecuado en cada caso. La Tuberculosis se subdivide normalmente en infección activa o latente. Durante la infección activa, los bacilos se replican activamente en los pulmones del paciente, causando daño en el tejido pulmonar. En estos casos, Mtb puede ser detectada en esputo y se observan diversos síntomas, ayudando en el diagnóstico de la enfermedad. La infección latente incluye distintos escenarios, tales como gente en la que Mtb se encuentra en un estado no replicativo, aquellos que se encuentran en estadíos tempranos previos al desarrollo de la infección activa, o gente que ha eliminado completamente al patógeno. El diagnóstico de la infección latente, sin embargo, se basa en la existencia de memoria inmunológica frente a antígenos de Mtb, lo cual puede dar lugar a falsos positivos en gente en la que ha eliminado la infección con participación del sistema inmune adaptativo. La ausencia de un gold standard para el diagnóstico de TB es una de las limitaciones de las herramientas diagnósticas actualmente disponibles. Otras limitaciones incluyen la incapacidad de pruebas como la prueba cutánea de la Tuberculona (TST) y el ensayo de liberación de interferón gamma (IGRA) de diferenciar entre infección latente y activa o distinguir a aquellos individuos que presentan un mayor riesgo de desarrollar TB activa. La necesidad de nuevas herramientas diagnósticas que ayuden a mejorar la precisión de las pruebas existentes en la actualidad nos ha llevado a la búsqueda de nuevos biomarcadores y herramientas para identificar los distintos estadíos de la enfermedad. Además, la identificación de las moléculas claves involucradas en la patogénesis y protección de la TB podría ayudar en el desarrollo de nuevas vacunas más eficaces, ayudando en la identificación de las dianas más adecuadas. Para la búsqueda de nuevos biomarcadores y de los eventos que mejor expliquen la respuesta inmune frente a la infección por Mtb, se ha llevado a cabo una amplia caracterización del perfil inmunológico y transcriptómico de los pacientes con TB activa y sus contactos. Los contactos fueron clasificados en contactos con infección latente (TLBI) o no infectados (NoTBI). Nuestro trabajo ha incluido el reclutamiento de los voluntarios bajo consentimiento informado. El reclutamiento ha sido llevado a cabo en el contexto del proyecto europeo EMITB, incluyendo a individuos de dos países con distinta incidencia de la TB (España y Mozambique). La caracterización del perfil inmunológico se basó en la distribución de leucocitos a nivel de sangre periférica, el inmunofenotipado de linfocitos circulantes y su perfil funcional, evaluado tras la activación con antígenos de la micobacteria, y la expresión de componentes de la respuesta inmune humoral, incluyendo citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento e inmunoglobulinas. Este análisis mostró que la TB activa induce cambios en la distribución periférica de neutrófilos, monocitos y linfocitos, con una mayor concentración de neutrófilos y monocitos y menos linfocitos que los contactos con infección latente o no infectaods. Entre los linfocitos, distintas subclases de linfocitos T helper, incluyendo a las células Th1, Th1-Th17, las de Memoria Central y las células MAIT CD8+presentaron una menor proporción en pacientes con TB activa. Los ratios de neutrófilos/linfocitos, monocitos/linfocitos y Th1/Th2 mostraron resultados prometedores como indicadores de TB activa, junto con las células Th1, Th1-Th17, las de Memoria Central y las células MAIT CD8+. Otros marcadores celulares potenciales identificados en nuestro trabajo fueron los linfocitos T γδ CD56+ o las células NK-bright. En todos estos casos, los pacientes con TB activa y los contactos latentes presentaron un perfil diferente, con lo que podrían ayudar a mejorar las herramientas diagnósticas actuales (TST/IGRA). Al igual que lo que ocurre con las pruebas TST e IGRA, las distintas subclases de células activadas de manera específica con antígenos de Mtb ayudaron a diferenciar los pacientes con TB activa y latente de los contactos no infectados. El perfil funcional, evaluado mediante la expresión de CD154 tras una incubación corta con una suspensión de Mtb irradiada, mostró un mejor rendimiento que la producción de IFNγ para discriminar entre esos grupos. Entre los distintos tipos celulares activados de manera específica, el porcentaje de células T de Memoria Central CD4+ CD154+ ha demostrado ser un buen marcador para la identificación de gente infectada. El análisis de las poblaciones circulantes sugiere una migración activa de células funcionales desde la periferia al sitio de infección local (los pulmones). Esto se vio reflejado también en el perfil de citocinas, dado que varias proteínas con propiedades quimio-atrayentes sobre células del sistema innato y adaptativo mostraron una mayor concentración en pacientes con TB active, tanto en suero como en saliva. Los marcadores potenciales identificados en suero incluyen BCA-1, IL-6, IL-7, IP-10, TGFα, TNFα e IL-27, mientras que los candidatos en saliva fueron EGF, Fractalkine, GRO, INFα2, IL-12p40, IL-16, IL-1α, IL-6, IP-10, MCP-1, MIP-1α y VEGF. Entre ellos, IP-10 y BCA-1 mostraron los mejores resultados en muestras de suero, puesto presentaban un perfil similar en muestras de ambas cohortes y diferencias entre pacientes con TB activa y los dos grupos de contacto. En el caso de las muestras de saliva, la quimiocina Fractalquina fue la candidata con un mejor rendimiento, seguido de VEGF. Nuestros resultados sugieren que el perfil proteico en saliva podría reflejar los procesos que tienen lugar a nivel de pulmón. Además de los factores humorales arriba descritos, los niveles de inmunoglobulinas también demostraron su potencial como marcadores de infección tuberculosa. Los pacientes con TB activa mostraron mayores niveles de anticuerpos totales y Mtb-específicos. Además, el perfil transcriptómico de los pacientes de TB mostró un alto número de genes que codifican cadenas de inmunoglobulinas, apoyando la importancia de estas moléculas. Junto a aquellos que codifican cadenas de inmunoglobulinas, otros genes del perfil transcriptómico de TB mostraron concordancia con parámetros inmunológicos evaluados mediante las otras técnicas. La abundancia de neutrófilos se reflejó en una mayor expresión de genes involucrados en la cascada de degranulación de los mismos y expresión de genes de péptidos antimicrobianos. Una mayor expresión de quimiocinas y factores de crecimiento mostró relación con la modulación de rutas involucradas en señalización a través de citocinas e interferón. Además, la modulación de rutas involucradas en la reorganización extracelular sugirió una relación con la movilización de células de la respuesta inmune y su proliferación durante la enfermedad. Genes involucrados en la cascada del complemento y la regulación de las células T también se encontraron en el perfil de TB. Todos estos eventos de la respuesta inmunitaria diferenciaron a los pacientes de TB de sus dos grupos de contactos, a excepción de la expresión de genes de inmunoglobulinas. En ese caso, las diferencias se encontraron solo entre TB activa y contactos no infectados. Los contactos con infección latente no mostraron un perfil de expresión génica distinto del de los contactos no infectados. Nosotros sugerimos que la ausencia de diferencias se debía a la heterogeneidad dentro del grupo de infección latente, en el que la mayoría de los individuos presentarían un perfil similar al de contactos no infectados. Esta heterogeneidad fue investigada en detalle mediante el uso combinado de los datos de secuenciación y una metodología de aprendizaje automático o machine learning. El perfil transcriptómico derivado de nuestro trabajo se usó para crear un modelo de clasificación basado en la expresión de genes diferencialmente expresados. El modelo resultante permitió la diferenciación entre gente con infección confirmada y gente carente de infección. Este modelo mostró un buen rendimiento tanto en la cohorte de entrenamiento (España) como en la de validación (Mozambique), indicando su robustez. Un nuevo procedimiento de clasificación fue implementado usando este modelo, en el que los pacientes con infección latente se clasificaron en base a la similitud de su perfil con aquel de los pacientes con infección confirmada o no infectados. Este procedimiento reveló que la mayoría de los contactos con infección latente tenían un perfil similar al de los no infectados, lo cual explicaría la ausencia de genes diferencialmente expresados. A este grupo lo llamamos NoTB-like. El pequeño porcentaje restante de contactos LTBI mostró un perfil similar al de pacientes con la enfermedad activa, sugiriendo que estos podrían tener un perfil de infección. A este grupo lo llamamos TB-like y su perfil de expresión se caracterizó por una mayor expresión de genes involucrados en la cascada del complemento, la señalización mediante citocinas y la producción de inmunoglobulinas. Esta similitud con algunos de los eventos que definen a la TB activa podría sugerir que estos individuos estuviesen en los primeros estadíos antes de desarrollar TB activa. En resumen, nuestro trabajo ha dado lugar a una variedad de marcadores en distintas muestras biológicas que podrían ayudar a identificar distintos perfiles de TB. Estos marcadores podrían ser empleados en el desarrollo de futuras pruebas diagnósticas. Además, hemos propuesto un nuevo procedimiento para estudiar la heterogeneidad dentro del grupo de latentes, lo cual podría ayudar a clasificar a un grupo cuyo diagnóstico está hoy en día limitado por la falta de un gold standard