Biotechnology applied to the modification of lignocellulosic materialsimprovement of the surface properties and manufacturing of biocomposites for 3D printing

Resumo

Se considera biomasa lignocelulósica a cualquier materia prima compuesta por celulosa, hemicelulosa y lignina. Además de estos compuestos, también pueden estar presentes pequeñas fracciones de extractivos alifáticos y fenólicos, pectinas, almidón y compuestos inorgánicos. La celulosa y las hemicelulosas son polisacáridos que se diferencian entre sí por el tipo de monómeros que las componen, de modo que la celulosa es un homopolímero compuesto por unidades de glucosa mientras que las hemicelulosas se componen de diferentes tipos de pentosas y hexosas. Por el contrario, la lignina no contiene polisacáridos en su estructura y está compuesto por tres unidades fenilpropanoicas unidas entre sí formando una compleja estructura tridimensional: alcohol coniferílico o unidades G, alcohol sinapílico o unidades S y alcohol p-cumarílico o unidades H. La proporción de los tres principales biopolímeros presentes en la biomasa lignocelulósica (celulosa, hemicelulosas y lignina) depende principalmente del origen de esta, diferenciándose de este modo entre frondosas, coníferas y hierbas. De hecho, tanto las frondosas como las coníferas se caracterizan por tener una mayor proporción de lignina que las hierbas. De ahí viene determinado la mayor rigidez de frondosas y coníferas respecto de las hierbas, ya que es precisamente la lignina la encargada de formar el esqueleto que dotará de una cierta rigidez a los materiales de origen lignocelulósico. Además de influir en la proporción de celulosa, hemicelulosa y lignina, el origen también determinará la estructura y la composición de la lignina. De este modo, en las coníferas predominan los monómeros de alcohol coniferílico mientras que en las frondosas y las hierbas son el alcohol sinapílico y el p-cumarílico los principales precursores, respectivamente. El impacto económico de la biomasa lignocelulósica en Europa es muy alto, y se incrementa de forma significativa en áreas rurales donde supone en muchos casos uno de los principales motores económicos. Desafortunadamente, el valor económico de los materiales obtenidos a partir de la biomasa es relativamente bajo, lo cual limita el crecimiento y el desarrollo económico de estas áreas rurales que dependen directamente del valor de la biomasa. Sin embargo, dada su estructura y composición química, los biopolímeros presentes en la biomasa podrían servir como precursores para la producción de múltiples compuestos químicos, productos y materiales, pudiendo llegar a sustituir en la mayoría de los casos al petróleo y sus derivados. Un buen ejemplo de esto son las industrias papeleras presentes en el norte de Europa que han transformado sus procesos de fabricación de pasta de papel en biorrefinerías donde se obtienen materias primas o directamente productos de origen renovable y con una gran cantidad de posibles aplicaciones, muchas de ellas muy específicas, lo cual contribuye a darle un alto valor añadido a la biomasa lignocelulósica. Si además del impacto económico, tenemos en cuenta otros factores como el daño al medioambiente, provocado por el uso excesivo del petróleo como principal materia prima, se puede afirmar que es absolutamente necesaria la valorización de la biomasa y la implementación de nuevos procesos y técnicas de producción basadas en los materiales de origen lignocelulósico. La utilización de las fibras lignocelulósicas para mejorar las propiedades mecánicas de matrices poliméricas supone un buen ejemplo de la valorización de este material. Desde un punto de vista medioambiental, se reduce la utilización de materiales de origen no renovable, ya bien sea por la menor cantidad de matriz polimérica requerida o por la sustitución de fibras sintéticas, como por ejemplo las fibras de vidrio, en favor de las fibras lignocelulósicas. Desde un punto de vista económico, se aporta un valor añadido a estas fibras lignocelulósicas que en muchos casos se consideran un subproducto de algunos procesos industriales. Además, la sustitución de materiales sintéticos por estas fibras de origen natural no tiene porqué suponer la obtención de un material con peores propiedades, sino más bien lo contrario. Sin embargo, estas fibras naturales tienen una serie de inconvenientes que deben ser mejorados para obtener un producto de calidad. Estos inconvenientes se deben a la alta hidrofilicidad y biodegradabilidad de las fibras lignocelulósicas y también a su baja estabilidad térmica. Por ello, estas fibras deben ser tratadas o modificadas para mejorar sus propiedades y reducir el impacto de los inconvenientes mencionados. Existen diferentes tratamientos químicos, físicos y biológicos que permiten funcionalizar la superficie de las fibras lignocelulósicas, dotándolas de nuevas propiedades bioquímicas que podrían ser explotadas en nuevas aplicaciones. Muchos de estos procesos de modificación de las fibras se basan en la unión de grupos funcionales a la superficie de las fibras, los cuales modifican las propiedades de las mismas. Sin embargo, es importante destacar que muchos de estos procesos químicos y físicos son altamente eficientes pero se basan en el uso de reactivos químicos peligrosos o dañinos para la salud humana o en su defecto, requieren una gran cantidad de energía para poder ser llevados a cabo. Además, ambos tratamientos físicos y químicos carecen de especificidad, lo que usualmente implica una modificación de todos los biopolímeros presentes en las fibras. Por el contrario, los tratamientos biotecnológicos se basan en la utilización de microorganismos y/o bio-macromoléculas para llevar a cabo la modificación de las fibras. Así, las condiciones necesarias para llevar a cabo estos tratamientos biotecnológicos son suaves, ya que se requieren temperaturas relativamente bajas y medio acuoso, limitándose en gran medida el consumo de energía y la utilización de reactivos químicos peligrosos. Además, muchos de los bio-macromoléculas como por ejemplo las enzimas se caracterizan por su especificidad, por lo que solo son capaces de atacar o modificar algunos de los compuestos presentes en las fibras. Por lo tanto, estos tratamientos biotecnológicos podrían considerarse sostenibles y respetuosos con el medioambiente. En la actualidad, muchos de los procesos industriales que emplean herramientas biotecnológicas se basan en enzimas. Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores en las reacciones químicas, que en el caso que nos ocupa pueden promover tanto la depolimerización como la polimerización de los biopolímeros. Entre las diferentes enzimas que se utilizan para modificar los materiales lignocelulósicos está la lacasa (NS51003). Esta enzima se caracteriza por tener la capacidad de oxidar estructuras fenólicas, dando lugar a la formación de radicales fenoxilo. Estos radicales pueden evolucionar posteriormente de diversas formas; si hay lignina presente, una posibilidad es que se unan de forma estable a la misma. Dado su bajo potencial de oxidación, las lacasas no pueden oxidar estructuras no fenólicas, lo cual dependiendo del objetivo final del tratamiento pueden considerarse una ventaja o un inconveniente. Sin embargo, mediante la adición de un compuesto mediador, es posible que las lacasas puedan oxidar estructuras no fenólicas como por ejemplo celulosa o ácidos grasos. En estos sistemas lacasa-mediador, la enzima oxida al mediador el cual presenta un mayor potencial de oxidación que la lacasa. De este modo, las reacciones en las que la lacasa actúa como catalizador permiten modificar en mayor o menor medida los biopolímeros presentes en las fibras lignocelulósicas, dependiendo siempre de las condiciones establecidas (lacasa sola o con un mediador). La modificación enzimática de los materiales lignocelulósicos generalmente se lleva a cabo mediante la unión estable de un sustrato a la superficie del material. Los sustratos pueden ser de origen sintético pero también de origen natural (por ejemplo lignina o taninos). Estos sustratos son compuestos fenólicos que poseen grupos funcionales que pueden dotar de nuevas propiedades a la superficie del material. Por ejemplo, los galatos son compuestos fenólicos que poseen una cadena alifática en su estructura, la cual puede otorgar propiedades hidrofóbicas y antimicrobianas a las fibras lignocelulósicas. Por otra parte, los taninos condensados son polifenoles presentes principalmente en la corteza de coníferas y leguminosas que podrían ser empleados como sustratos para otorgar nuevas propiedades a los materiales lignocelulósicos. Además, los taninos se pueden modificar químicamente, lo que podría darles nuevas propiedades bio-químicas. La modificación y mejora de las propiedades de las fibras lignocelulósicas mediante la unión estable de compuestos en su superficie permitirá la utilización de estas fibras naturales en nuevas aplicaciones. Una de las más interesantes es la fabricación de biocomposites, los cuales se están estudiando y/o ya se utilizan en diferentes industrias como la automovilística o la aeroespacial. Los biocomposites son materiales compuestos al menos por una fase de origen biológico. Generalmente, la fase dispersa la componen bio-fibras que refuerzan a la fase matriz, que puede ser o no un polímero bio-basado. La utilización de las fibras lignocelulósicas permite reducir el peso de los biocomposites, mejorar su biodegradabilidad y mejorar las propiedades mecánicas del material. Para lograr esto último es primordial tener una buena adhesión entre las fibras y la matriz, algo que solo es posible mejorando la compatibilidad química entre las fibras (hidrofílicas) y la matriz (hidrofóbica). Por ello, la modificación previa de las fibras para dotarlas de una cierta hidrofobicidad es un paso obligatorio para mejorar la adhesión en la interfase entre la matriz y las fibras. Los biocomposites también pueden ser una interesante materia prima para los procesos de impresión 3D. La impresión 3D permite la producción rápida de prototipos con complejas estructuras, reduciendo significativamente los tiempos de producción así como el consumo de materias primas, lo cual tiene un impacto importante en los costes de producción de un determinado objeto. Aunque existen varios tipos de tecnología 3D, una de las más comunes es la tecnología FDM (Fused Deposition Modeling). Esta técnica consiste en extruir un filamento haciéndolo pasar a través de una nuez que imprime el objeto capa a capa de abajo hacia arriba. Para lograr una buena impresión de un biocomposite mediante la técnica FDM es importante que no existan puntos de aglomeración de las fibras, para lo cual la compatibilidad química entre la matriz y las fibras juega un papel crucial. Por lo tanto, los objetivos de la presente tesis se resumen a continuación: 1. Estudio de las condiciones del tratamiento con lacasa (pH, tiempo de reacción, dosis de enzima y concentración del sustrato) de materiales lignocelulósicos para mejorar la unión estable entre el sustrato y la superficie del material. 2. La valorización de extractivos fenólicos (taninos condensados) para su uso en tratamientos asistidos por lacasa. 3. La producción de biocomposites para su aplicación en procesos de impresión 3D a partir de plásticos biobasados y fibras lignocelulósicas tratadas enzimáticamente. Para la optimización de la unión estable entre un sustrato fenólico y la superficie de un material lignocelulósico mediante un tratamiento asistido por lacasa se estudiaron varios parámetros tales como pH, tiempo de reacción, dosis de enzima y la concentración del sustrato, los cuales tienen una importancia destacable en el proceso. Mediante el uso de taninos condensados de corteza de Pinus radiata se descubrió que para este tipo de compuestos tiene una mayor importancia el pH al cual los compuestos se desprotonan (pH > 9) que el pH óptimo para la enzima (pH ≈ 7). De hecho, el estudio de la auto-fluorescencia de la superficie de las maderas tratadas a una longitud de onda de 672 nm evidenció que a medida que se incrementaba el pH del tratamiento enzimático mayor era la intensidad de la luz emitida por las maderas tratadas, alcanzándose a pH 10 la mayor intensidad de luz emitida. Este hecho se observó con mayor claridad en las probetas tratadas con taninos modificados químicamente mediante hidroxipropilación, en los cuales la intensidad de la luz emitida a 672 nm fue mucho mayor que la que emitieron las probetas tratadas con taninos sin modificar. Probablemente, mediante la hidroxipropilación los taninos redujeron su reactividad, lo que incrementó la estabilidad de los radicales producidos por la lacasa y favoreció una mayor unión de polifenoles a la superficie de las probetas de madera. De este modo, los resultados sugieren que además del pH, la posible protonación/desprotonación del sustrato es un factor relevante. Dado que los taninos consensados utilizados son una mezcla de diferentes estructuras químicas (estilbenos, flavonoides, terpenos y catequinas) se decidió utilizar el lauril galato (LG) como sustrato modelo y láminas de haya como material lignocelulósico para estudiar las condiciones del tratamiento enzimático que favorecen la unión estable de un compuesto fenólico a un material lignocelulósico. El LG tiene una cadena alifática de doce carbonos que incrementará significativamente la hidrofobicidad de la superficie de la madera, por lo que midiendo el ángulo de contacto que forma una gota de agua con la superficie se podría medir cualitativamente la unión del compuesto a la superficie. Para estudiar el efecto de las principales variables que podrían afectar a este proceso, se diseñó un experimento en el que se estudiaron diferentes dosis de enzima (3.4, 5, 6.7 U / cm2 de madera), tiempos de tratamiento (1, 2, 4 horas) y concentración de sustrato (2.5, 5, 10 mM). Los resultados del estudio demostraron que las condiciones que dotaban de una mayor hidrofobicidad a las láminas de haya fueron 2 horas de tratamiento con 5 mM de LG y 5 U de lacasa por cm2 de madera. Además de las condiciones del tratamiento, las propiedades físicas y químicas del material lignocelulósico a modificar también pueden influir en el resultado obtenido. Por ello, láminas de diferente origen (frondosas y coníferas) fueron tratadas con LG en las condiciones óptimas determinadas previamente para medir la influencia del origen de la especie del material a tratar. Se observó que el mayor y menor incremento en el ángulo de contacto se obtuvo en las láminas de pino (coníferas) y eucalipto (frondosas), respectivamente. La lignina de estas dos especies difiere en el ratio entre unidades S y G, siendo éste menor en la lignina de pino que en la de eucalipto. Por ello, los resultados obtenidos sugieren que una mayor presencia de unidades G en la estructura química de la lignina favorece la unión de LG a la superficie de las láminas de madera. Las mismas condiciones empleadas para tratar las láminas de madera se emplearon para modificar con LG fibra de pasta termomecánica de madera de Picea abies. Sin embargo, bajo estas condiciones no se consiguió unir de forma estable el LG a las fibras ya que estas no mostraron ninguna hidrofobicidad después del tratamiento. Aparentemente, la presencia de extractivos en la superficie de las fibras dificultan o impiden la unión estable del LG a la superficie de las fibras. Por ello, se utilizó un sistema lacasa-mediador para conseguir anclar el LG a la superficie de las fibras. Es conocido que los sistemas lacasa-medidor pueden reducir significativamente la proporción de extractivos alifáticos presentes en las fibras lignocelulósicas, lo cual facilitaría una mayor activación de la lignina presente en la superficie de las fibras y a la vez una mayor unión del LG. Este hecho se observó en las fibras tratadas con los dos mediadores (guaiacol y vainillina) estudiados, ya que la hidrofobicidad aumentó de forma importante en los tratamientos lacasa-vainillina y de forma muy significativa en los tratamientos lacasa-guaiacol. De hecho, el ángulo de contacto de las fibras tratadas con guaiacol fue de 100 ⁰ y permaneció prácticamente constante a lo largo de las mediciones realizadas durante X minutos. La diferencia entre el guaiacol y la vanilina se podría deber a que esta última tiene un grupo aldehído en la posición para-, los cuales son aceptores de electrones, reduciendo la estabilidad de los radicales formados y a la vez dificultando la unión estable del LG con las fibras. Por ello, es importante destacar que tanto la composición química de la lignina como su accesibilidad en la superficie del material lignocelulósico son parámetros extremadamente importantes para unir de forma estable el LG. Se demostró que la unión del LG a la superficie de un material lignocelulósico aumenta significativamente la hidrofobicidad del material. Este hecho puede dotar al material de nuevas propiedades o mejorar su procesamiento en aplicaciones ya existentes actualmente. Además, la presencia de compuestos como el LG puede mejorar las propiedades antibacterianas del material. Una posible aplicación de este material lignocelulósico modificado enzimáticamente con LG podría ser su utilización como material que limite la adhesión de microorganismos a su superficie. Generalmente, los microorganismos como las bacterias se adhieren a la superficie de los materiales formando una película biológica compuesta de carbohidratos y proteínas que modifica las propiedades superficiales del material, protege a los microorganismos y dificulta la eliminación de los mismos. Por ello, limitar la adhesión microbiana y reducir el tamaño de esta película biológica que forman, es un paso necesario para producir materiales con propiedades antimicrobianas. De este modo, se estudió si las láminas de madera hidrofobizadas con LG reducían la adhesión bacteriana. Como microorganismo se utilizó la Cobetia marina, que es una bacteria modelo de ecosistemas marinos. Se decidió estudiar la Cobetia marina dada las difíciles condiciones a la que se ven expuestos los materiales lignocelulósicos en los ecosistemas marinos (condiciones húmedas y gran cantidad de microorganismos). La medición de la cantidad de proteína recuperada tras la disrupción celular de las bacterias presentes en la superficie de las láminas de madera demostraron que las láminas con una mayor hidrofobicidad (tratadas con lacasa y LG) tenían una menor concentración de proteína, lo cual está directamente relacionado con una menor adhesión bacteriana. Las fotografías de la superficie del material tomadas por microscopía electrónica confirmaron los resultados obtenidos en la medición de proteína ya que las láminas hidrofobizadas tenían una menor presencia bacteriana que las no tratadas. Estos resultados sugieren que el tratamiento enzimático con LG puede ser un interesante mecanismo para dotar de propiedades antibacterianas a los materiales lignocelulósicos. Por otra parte, la producción de biocomposites debe ser un importante nicho para el uso y valorización de las fibras lignocelulósicas. Pero como se mencionó anteriormente, algunas propiedades químicas como la hidrofilicidad de las fibras deben ser modificadas para mejorar su compatibilidad con las matrices poliméricas. Previamente se demostró que era posible unir de forma estable LG a las fibras termomecánicas mediante un sistema lacasa-mediador y que esta modificación mejoraba sustancialmente la hidrofobicidad de las fibras. Además del LG, también se modificaron enzimáticamente fibras con octil galato (OG) que tiene una menor hidrofobicidad que el LG. Por otra parte se ensayaron diferentes condiciones para la elaboración de filamentos biobasados: diferentes compuestos para funcionalizar las fibras (LG y OG), porcentajes de fibras (10 y 20%), matrices poliméricas (PLA y dos tipos de BioPE). Las imágenes tomadas por microscopía electrónica demostraron que la compatibilidad química y la adhesión interfacial entre la matriz y las fibras mejoró de forma importante con las fibras que habían sido hidrofobizadas previamente. En el caso del PLA se observó que esta compatibilidad era mejor con las fibras tratadas con OG y para el BioPE con las fibras tratadas con LG. En cuanto a los dos tipos de BioPE empleados se observó de forma clara que con un alto índice de fluidez se empeora da compatibilidad entre la matriz y las fibras, dando lugar a producción de filamentos con una alta porosidad y rugosidad superficial, las cuales son características nada deseables para su aplicación en impresión 3D. Por el contrario, el BioPE con un menor índice de fluidez permitió la producción de filamentos con una menor porosidad y rugosidad superficial. También se demostró que los filamentos producidos con las fibras previamente hidrofobizadas mostraron una menor absorción de agua comparado con las fibras no tratadas, especialmente en los filamentos que contenían un 20 % de fibras. Finalmente, se observó que los filamentos biocompuestos de PLA son imprimibles en 3D mientras que para las series de BioPE solo se pudieron imprimir tridimensionalmente los filamentos producidos con el BioPE2. Es importante destacar que hasta la fecha no existe ninguna publicación científica acerca de la impresión 3D de biocomposites basados en polietileno (PE). Esto se debe a que la impresión 3D del PE es muy complicada dados las tensiones internas que sufren las capas impresas cuando se enfrían. Sin embargo, en esta tesis se demostró que la adición de fibras a la matriz de BioPE mejoró la adhesión entre las capas impresas y limitó el encogimiento y el curveo de los objetos imprimidos.