Implicación del transportador abci4 de leishmania major en resistencia a fármacos e infectividad

Resumen

RESUMEN La leishmaniasis es la segunda enfermedad parasitaria en importancia por detrás de la malaria, tanto desde el punto de vista de la prevalencia anual de casos como de la letalidad de alguna de sus variantes, en el caso de no ser tratada. Según los datos de la OMS, hay 350 millones de personas en el mundo en riesgo de padecer la enfermedad, dándose de forma estimada de 0,2 a 0,4 millones de casos de leishmaniasis visceral y de 0,7 a 1,2 millones de casos de leishmaniasis cutánea cada año. Ante la ausencia de una vacuna eficaz, solo queda llevar a cabo programas de control de las poblaciones del insecto vector y tratamientos quimioterapéuticos de los afectados. Actualmente existe un muy reducido arsenal de fármacos para el tratamiento de la leishmaniasis, empleándose aún como primera línea, los antimoniales pentavalentes, cada vez más criticados desde el punto de vista del fallo terapéutico por aparición de resistencias en zonas endémicas. Se trata de un hecho preocupante y cada vez más frecuente, siendo necesario el desarrollo de nuevos fármacos eficaces o el empleo de compuestos que reviertan las resistencias generadas a los fármacos ya existentes. Los transportadores ABC representan una de la familia de proteínas más amplia presente tanto en procariotas como en eucariotas, llevando a cabo funciones muy diversas, y muchas de ellas de gran relevancia clínica. El genoma de Leishmania contiene 42 genes codificantes para transportadores ABC (Leprohon et al. 2006), clasificados a su vez en varias subfamilias desde la A hasta la H, excepto 4 genes con muy baja homología con el resto de los transportadores ABC incluidos en un grupo denominado como ¿otros¿, al cual nuestro grupo ha denominado como ABCI, y que engloba a los genes ABCI1 (LmjF12.1190), ABCI2 (LmjF32.2060), ABCI3 (LmjF33.3040) y ABCI4 (LmjF33.3260), todos ellos codificantes para ABC ¿half-transporters¿, con una disposición del NBD en el extremo carboxilo pero con el requerimiento común de formar homo-/heterodímeros para ser funcionalmente activos. A lo largo del presente trabajo de tesis doctoral, se ha estudiado la implicación del transportador ABCI4 del parásito Leishmania en la resistencia a fármacos e infectividad. El porcentaje de homología tan bajo con otros transportadores ABC de Leishmania, y con eucariotas en general, lo convierte en un transportador interesante de estudio, ya que podría emplearse como diana terapéutica en el tratamiento de la leishmaniasis. El transportador ABCI4 pertenece a la familia ABC (ATP-binding cassette), y presenta un grado de homología muy bajo con otros transportadores ABC de Leishmania, aunque mayor con transportadores mitocondriales de la familia ABCB, que poseen una disposición TMD-NBD. Se demuestra en este trabajo de tesis la implicación de ABCI4 en el eflujo de metales pesados, confiriendo así resistencia a Pentostam®, SbIII, AsIII y CdII. La resistencia observada se explica gracias a la menor acumulación de estos compuestos debido a un eflujo significativamente mayor. Se ha demostrado mediante ensayos de co-inmunoprecipitación que el transportador ABCI4 forma homodimeros para realizar su función de transporte. A su vez, se empleó una combinación de estudios de localización subcelular empleando microscopía confocal y ensayos de biotinilacion sirviendonos de parásitos que expresan ABCI4 fusionado a GFP- y a FLAG-, observando que el transportador tenía una localización dual en mitocondria y membrana plasmática. Además, los parásitos que sobreexpresaban ABCI4 presentaron un incremento en la replicación en el interior de macrofágos peritoneales de ratón. En este trabajo de tesis determinamos también que algunas porfirinas son sustrato del transportador ABCI4. Consecuentemente, la sobreexpresión de ABCI4 confería resistencia a algunas porfirinas tóxicas, tales como zinc-protoporfirina, debido a la menor acumulación resultante de un eflujo significativamente mayor. Además, observamos que ABCI4 tiene una significativa capacidad de exportar tioles tras la incubación con SbIII, pudiendo considerar al transportador ABCI4 como una potencial bomba tiol-X que es capaz de reconocer metales conjugados con tioles. Por otro lado, se investigaron una serie de 15 compuestos, potenciales inhibidores de la actividad de ABCI4, derivados o analogos de flavonoides y trolox, evaluando su actividad revertidora de la resistencia a antimonio en los parásitos que sobreexpresaban ABCI4. Entre los compuestos evaluados, N-etiltroloxcarboxamida (compuesto D2), produjo la mayor actividad. Con el fin de optimizar la actividad del compuesto D2, sintetizamos una serie de 10 derivados (compuestos D3 a D12) mediante la condensación de varias aminas con trolox. El análisis de la actividad revertidora de la resistencia a antimonio mostró que N-propiltroloxcarboxamida (compuesto D4) era el inhibidor más potente de ABCI4. La actividad revertidora se mantuvo en amastigotes intracelulares obtenidos tras la infección de células THP-1. Además, los derivados de trolox revertían significativamente la resistencia a la porfirina toxica zinc-protoporfirina. El mecanismo de acción de estos derivados activos se demostró ligada a la reversión significativa de la acumulación de SbIII y zinc-protoporfirina, debido al descenso en el eflujo del fármaco. Dado que el transportador ABCI4 puede ser considerado como una bomba tiol-X, determinamos la capacidad de los derivados de trolox de revertir el eflujo de tioles no proteicos en las líneas de L. major en presencia de SbIII. La relación estructura-actividad estudiada en la presente tesis remarca la importancia del tamaño y longitud del sustituyente alquilo de trolox. En resumen, hemos demostrado que ABCI4, un nuevo transportador ABC de Leishmania, se encuentra implicado en la resistencia a antimonio, otros metales y porfirinas mediante un incrementode su eflujo al exterior celular y que los compuestos derivados de trolox D2 y D4 podrían ser considerados como agentes revertidores específicos de la actividad de ABCI4.