Análisis de la función de la rpb7, la sumo e3 ligasa siz1 y la sumoilación de la cromatina en la regulación del sitio de expresión de la vsg en trypanosoma brucei

Abstract

Trypanosoma brucei es un parásito extracelular perteneciente a la familia Trypanosomatidae del reino protista, que causa la enfermedad del sueño o tripanosomiasis africana en humanos y la nagana en el ganado. Su ciclo de vida alterna entre dos hospedadores: un insecto vector del género Glossina (la mosca tsetsé) y un hospedador mamífero (Matthews, 2005). El parásito se multiplica en el torrente sanguíneo del hospedador evadiendo la respuesta inmunitaria mediante una estrategia muy sofisticada de variación antigénica de su glicoproteína de superficie, VSG (Variant Surface Glycoprotein) (Donelson, 2003; Pays, 2006; Taylor and Rudenko, 2006). La forma sanguínea del parásito está cubierta por una capa densa de esta glicoproteína que cambia de manera estocástica con una cierta frecuencia en la población (10-2 ¿ 10-5). El genoma del parásito presenta más de mil copias de genes VSG, de la cuales aproximadamente 20 se encuentran en regiones conocidas como Sitios de Expresión del gen VSG (VSG-ES; VSG Expression Site) y sólo uno está activo en un momento dado. Los mecanismos moleculares que controlan la expresión monoalélica de la VSG son mayoritariamente desconocidos. La transcripción de las dos glicoproteínas de superficie es llevada a cabo por la RNA polimerasa I (RNAPI), un complejo que normalmente no transcribe RNAs codificantes en otros eucariotas. Esta inusual característica puede estar acompañada por el reclutamiento de subunidades específicas o factores de transcripción que confieren a la RNAPI la capacidad de transcribir RNA mensajeros (mRNAs). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio usando una línea celular doble reportera, sugieren que la transcripción mediada por RNAPI requiere de la TbRPB7, una subunidad específica de la RNAPII en eucariotas (Penate, 2007). En esta tesis se caracteriza el papel funcional de la TbRPB7 en la transcripción de la RNAPI de T. brucei. Mediante experimentos de coinmunoprecipitación encontramos que TbRPB7 interactúa con TbRPA1 y TbRPB6z, dos subunidades específicas del complejo RNAPI. Ensayos de transcripción in vivo señalan que la transcripción de los genes VSG y 18S rDNA se reduce tras la depleción de TbRPB7 por RNA de interferencia (RNAi). Además, ensayos de transcripción in vitro muestran que la actividad transcripcional del promotor VSG incrementa tras la adición de proteína TbRPB7 recombinante y se reduce tras su inmunodepleción. Posteriormente se ha analizado el perfil de ocupación de la proteína TbRPB7 mediante ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) y hemos detectado que TbRPB7 se asocia in vivo con el VSG-ES activo y no con los inactivos, de forma similar a TbRPA1, la subunidad mayor del complejo RNAPI. En los complejos RNAPII, la RPB7 se ha visto implicada tanto en el reclutamiento de factores de procesamiento del mRNA (Mitsuzawa et al., 2003) como con factores de transcripción (Na et al., 2003; Petermann et al., 1998). Estos trabajos sugieren que en T. brucei, TbRPB7 podría desempeñar una función similar regulando la transcripción de los genes VSG y prociclina por la RNAPI, mediante su interacción con factores de transcripción, factores de elongación, etc. Con el fin de identificar posibles interacciones de TbRPB7 con proteínas involucradas en la regulación de la transcripción de la VSG, se realizó un ensayo de doble híbrido en levadura. Mediante esta aproximación se encontraron varias proteínas, incluyendo una con un dominio conservado MIZ/SP-RING, característico de las SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) E3 ligasas (Melchior et al., 2003), denominada en esta tesis TbSIZ1. SUMO es una modificación postraduccional de proteínas que se ha visto involucrada en diversos procesos celulares en eucariotas superiores. El grupo más común de sustratos modificados por SUMO son los factores de transcripción, cuya actividad puede ser modificada positiva o negativamente como consecuencia de la SUMOilación (Lyst and Stancheva, 2007). Las enzimas SUMO E3 ligasas aparecen en el último paso de la cascada enzimática de SUMOilación, catalizando la transferencia del grupo SUMO y determinando la especificidad del sustrato (Johnson and Gupta, 2001; Takahashi et al., 2001). La depleción de TbSIZ1 mediante RNAi reduce la señal nuclear de proteínas conjugadas con SUMO detectadas por inmunofluorescencia (IF), lo que sugiere que TbSIZ1 posee actividad SUMO ligasa in vivo. Asimismo análisis de IF de doble marcaje y colocalización, sugieren que regiones nucleares con alta concentración de proteínas SUMOiladas colocalizan con el VSG-ES activo en el núcleo. Por otro lado, investigamos la presencia de proteínas SUMOiladas asociadas a la cromatina del VSG-ES por ChIP y encontramos un enriquecimiento significativo a lo largo de todo el VSG-ES activo y en la región aguas arriba del promotor activo. Por el contrario, no se detectaron proteínas SUMOiladas en los VSG-ESs inactivos ni en otros loci analizados como el DNA ribosomal (rDNA) o el promotor del SL (Splice leader), transcritos por la RNAPI y la RNAPII respectivamente. Estos resultados sugieren que la SUMOilación de proteínas asociadas a la cromatina podría ser una característica singular del VSG-ES activo. A continuación analizamos el efecto de la depleción de la SUMO E3 ligasa TbSIZ1, en la ocupación de proteínas conjugadas con SUMO detectadas en el VSG-ES activo. La depleción de TbSIZ1 reduce la señal de proteínas SUMOiladas detectadas por ChIP, lo cual se correlaciona con una disminución en los niveles de TbRPA1 en el VSG-ES activo y una reducción en la tasa de trascripción de la VSG. Sin embargo, este efecto parece ser sobre la actividad transcripcional de la RNAPI, ya que se observa una reducción similar en la ocupación de TbRPA1 y en la transcripción del gen ribosomal 18S. En conjunto los resultados sugieren que TbSIZ1 funciona como una SUMO E3 ligasa in vivo y que es requerida para la SUMOilación de proteínas asociadas a la cromatina del VSG-ES activo, lo cual podría ser importante para el reclutamiento de la RNAPI, factores de transcripción o proteínas remodeladoras de la cromatina, al promotor VSG activo para su eficiente trascripción.