Influencia de la movilidad de las hélices en la función de la bacteriorodopsina

Resumo

La bacteriorodopsina (BR) es una proteína transportadora de protones que se encuentra en la membrana de la arqueobacteria H. salinarum. Consta de siete hélices α y un cromóforo, el retinal, unido covalentemente a la hélice G. Ha sido muy estudiada debido a su similitud con la rodopsina visual y otras proteínas de la familia de las GPCRs, además de formar parte de uno de los sistemas fotosintéticos más sencillos que se conocen. La BR se activa mediante la absorción de un fotón por parte del retinal, lo que proporciona la energía necesaria para realizar el fotociclo. El resultado final es el transporte neto de un protón desde el lado citoplasmático al lado extracelular. A pesar de que su estructura y función son bien conocidas, todavía hay aspectos funcionales que no han sido suficientemente caracterizados. En este sentido, la existencia de un posible movimiento de las hélices E, F y G en el lado citoplasmático durante el proceso de reprotonación ha sido ampliamente debatida. El hecho de que estos movimientos hayan sido detectados solamente en estructuras cristalográficas de mutantes ha llevado a pensar que podría tratarse de un artefacto. Asimismo, los trabajos de Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) en proteína marcada con una sonda de spin han dado valores muy diversos para la magnitud de estos movimientos, creando también dudas sobre su existencia y su implicación en la función. Este trabajo ha tenido como objetivo estudiar la influencia de la flexibilidad de las hélices E-F y F-G en la función de la BR. Para ello se ha expresado una quimera de la BR, denominada Loop5, donde se ha ampliado la longitud, y por tanto la flexibilidad, del bucle E-F mediante la sustitución del bucle nativo por su homólogo en la rodopsina. Por otro lado se ha restringido la flexibilidad de las hélices E-F y F-G mediante la expresión de dos dobles mutantes cisteína y la formación de un puente disulfuro interhélice: F153C(E)/R175C(F) y E166C(F)/A228C(G). Tanto el aumento de la flexibilidad del bucle E-F como la restricción de la movilidad de estas hélices y de las hélices F-G provocan una profunda alteración en la función de transporte. Asimismo el estudio de estos mutantes sitúa este cambio entre los intermediarios M y N y demuestra que es imprescindible para que pueda darse el cambio de accesibilidad desde el lado extracelular al lado citoplasmático, mecanismo que asegura que el transporte sea unidireccional. El aumento de flexibilidad del bucle E-F tiene como consecuencia el aceleramiento del intermediario M. El intermediario N aparece más temprano y tiene un mayor tiempo de vida media. Durante este intermediario sería cuando la proteína tiene una apertura hacia el lado citoplasmático. Al restringir la flexibilidad de las hélices E-F en el mutante F153C/R175C los cambios en el fotociclo no parecen tan relevantes, sin embargo el estudio del intermediario N mediante FTIR muestra cambios estructurales importantes respecto a la proteína nativa. La restricción de la flexibilidad de las hélices F-G en el mutante E166C/A228C provoca profundas alteraciones en el fotociclo favoreciendo la acumulación del intermediario M. Los intermediarios N y O (durante los cuales se reprotona la BR) no se forman y el fotociclo sigue otro camino alternativo para volver al estado basal. Además, el hecho de que el proceso de expulsión del protón (que tiene lugar en el lado extracelular) esté afectado indica la existencia de un mecanismo de cuerpo rígido durante el fotociclo. Por tanto, la flexibilidad de las hélices E, F y G tiene un papel muy relevante en la función de la BR, sugiriendo que este mecanismo es importante en proteínas que constan de 7 hélices transmembrana (7TM). La estrategia de formar un puente disulfuro interhélice en la BR, mediante la introducción de dos cisteínas por mutagénesis dirigida, ha demostrado ser un buen método de estudio para determinar la relevancia de la flexibilidad de las hélices en la función de la proteína. Este método podría extrapolarse a otras proteínas 7TM.