Biosensores selectivos de adn basados en un nuevo indicador electroquímico y nanopartículas de oro

Resumo

trabajo de tesis realizado por Dña. Tania García Mendiola bajo la dirección de la Dra Encarnación Lorenzo y la Dra Elena Casero, todas ellas pertenecientes al Departamento de Química Analítica y Análisis Instrumental de la Universidad Autónoma de Madrid, ha trabajado en el desarrollo de un método basado en el empleo de un compuesto derivado de rutenio (Ru) para la detección de secuencias de ADN determinadas, la presencia de desapareamientos en dichas secuencias, así como su posición en las mismas. El diagnóstico molecular basado en el análisis de secuencias cortas de ADN ofrece métodos sensibles y cuantitativos para la detección temprana de enfermedades infecciosas producidas por patógenos. La hibridación del ADN (unión de dos hebras complementarias de ADN) es el proceso más común para analizar y detectar un gen particular o un segmento de un ácido nucleico. Entre los métodos basados en hibridación, el más empleado es el uso de fragmentos de ADN o ARN marcados radiactivamente, conocidos como sondas. De hecho, esta metodología es la base de la amplificación controlada de ADN conocida como PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) que se utiliza para la clonación y secuenciación de ADN. Dentro de los métodos basados en hibridación, los biosensores electroquímicos de ADN presentan ventajas en comparación con los métodos citados. Una de las ventajas de los biosensores es la posibilidad de desarrollar dispositivos portátiles simples para la realización de diagnósticos. Además, el acoplamiento entre estos biosensores de ADN y las técnicas de amplificación por PCR pueden proporcionar una gran sensibilidad para la detección de secuencias específicas de ADN y sus alteraciones relacionadas con ellas como ciertos tipos de cáncer, dolencias cardiacas, enfermedades hepáticas, etc. Sin embargo, a pesar del gran esfuerzo dedicado al desarrollo de este tipo de biosensores, no existen dispositivos en el mercado capaces de funcionar con muestras reales con el grado de selectividad adecuado y de forma rápida y sencilla, con los mínimos pasos de pretratamiento o marcaje del analito. Por ello, es de enorme interés el seguir avanzando en el desarrollo de nuevos biosensores de ADN como el que se describe en esta memoria de tesis, capaz de detectar secuencias de ADN así como alteraciones de las mismas en muestras reales (no marcadas), de forma rápida, sencilla y en tiempo real. En el trabajo que realizado en esta tesis doctoral se ha desarrollado un método electroanalítico muy selectivo para la detección de secuencias de ácidos nucleicos empleando como indicador de hibridación un nuevo complejo de rutenio, preparado ¿in situ¿, denominado complejo de pentamin rutenio [3-(2-fenantren-9-il-vinil) piridina] (referido en el texto como RuL) que reacciona selectivamente con el ADN hibridado. La alta sensibilidad y especificidad conseguida con el complejo RuL permite detectar y cuantificar, sin necesidad de ningún tipo de marcaje, no sólo una secuencia determinada de ácido nucleico, aunque esta tenga un número de pares de bases superior a 100, sino también la presencia y localización de un único desapareamiento en una base de dicha secuencia. De acuerdo a lo descrito anteriormente, durante la realización de esta tesis doctoral, se han puesto a punto diferentes metodologías para el desarrollo de biosensores electroquímicos, basados en el uso de este indicador y nanopartículas de oro, para la detección de secuencias sintéticas de ADN y posteriormente ser aplicados a muestras reales de ADN. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral ponen de manifiesto la utilidad del biosensor de ADN para la determinación rápida y sencilla de secuencias de ADN, procedentes de muestras reales de interés clínico en el diagnóstico de enfermedades