Novel designable and biocompatible solventsbiodegradability, synthesis and application

Resumen

Hoy en día la sociedad avanza a un ritmo vertiginoso marcado por la incorporación a nuestro día a día de las aplicaciones surgidas de la investigación científica y tecnológica. Sin embargo, la tecnología y sus derivados (por ejemplo, la mayoría de los productos que utilizamos en nuestra vida cotidiana) suponen actualmente un coste que puede llegar a ser crucial para nuestro futuro: el ambiental. En las últimas décadas, esta “tarifa” y sus consecuencias han sido motivo de estudio y, como resultado, la sociedad actual busca un cambio industrial y social hacia la sostenibilidad. La Unión Europea (EU por sus siglas en inglés) juega un papel crucial en esta transformación mediante sus capacidades tanto legislativas como financieras para promover novedosas investigaciones o incluso el inicio de la “revolución verde” en la industria europea. En este contexto, si se analizan los datos oficiales de la Agencia Medioambiental Europea (EEA por sus siglas en inglés) puede concluirse que uno de los sectores industriales con más impacto y mayor capacidad de mejora es el perteneciente a la “Industria Química”. Existen estudios que abordan las causas del gran impacto ambiental de estos procesos productivos. Por ejemplo, la industria farmacéutica resulta ser una de las menos eficientes ambientalmente (generan más Kg de residuos por Kg de producto final) y esto se ha relacionado con reacciones químicas que no utilizan catalizadores o al uso generalizado de disolventes orgánicos volátiles. De hecho, los disolventes (orgánicos volátiles) convencionales son ampliamente utilizados en la industria y su reemplazo por otros químicos más reutilizables y con menor impacto ambiental puede ser decisivo para que la industria química pueda evolucionar hacia la sostenibilidad. En este escenario, los líquidos iónicos (ILs por sus siglas en inglés) aparecieron como una alternativa prometedora para sustituir estos disolventes e incluso una oportunidad para el diseño racional de procesos productivos más eficientes. La comunidad científica reconoce que la primera definición de un IL fue dada por el Dr. Paul Walden en 1914: sal cuyo punto de fusión es igual o menor a 100 ºC. Desde entonces los ILs han sido ampliamente estudiados y, debido a la complejidad y gran variedad de estos compuestos, dar una definición específica hoy en día es una tarea no sólo compleja, sino que también controvertida. En cualquier caso, es este criterio (100 ºC) el que actualmente se emplea para discernir si un material puramente iónico es o no es un IL. Cuando en los años 90 se propuso el uso de estas sales líquidas para (i) desarrollar nuevos procesos en el marco de la “química verde” (Green Chemistry en inglés) y más en particular para (ii) substituir disolventes orgánicos tradicionales, se produjo un aumento exponencial en el número de trabajos abordando el estudio de estas sustancias. Como resultado, estos disolventes son conocidos hoy en día por su gran versatilidad y aplicabilidad en diversos campos. De hecho, la capacidad de modificar fácilmente las propiedades físico-químicas del IL final mediante un diseño racional del disolvente es probablemente su característica más provechosa. Esta propiedad se denomina tuneabilidad (tunability en inglés) y viene dada por la naturaleza dual de estas sustancias (catiónica y aniónica), la cual permite seleccionar los iones más adecuados para obtener el IL con el mejor rendimiento en la aplicación objetivo. Cabe resaltar que, en este sentido, existe un número inabarcable de posibles combinaciones de iones. Actualmente se ha descrito un gran número de aplicaciones para los ILs, siendo algunas de las más relevantes su uso como disolventes, catalizadores, disolventes catalíticos, electrolitos, modificadores de materiales, lubricantes, agentes rompedores de azeótropos o incluso como combustibles para viajes espaciales. Sin embargo, una de las líneas de investigación sobre los ILs más relevantes del nuevo milenio ha sido el estudio del destino ambiental de estos compuestos, principalmente mediante la determinación de su “toxicidad” y “biodegradabilidad”. Los resultados revelaron que muchas de las familias de IL más utilizadas hasta entonces presentan una notable toxicidad y una muy baja biodegradabilidad, llegando a ser a veces incluso más dañinos que los disolventes convencionales que venían a remplazar o considerados como persistentes en el medioambiente (“recalcitrantes”). No obstante, estos estudios también demostraron que los ILs basados en sustancias naturales (tales como el catión colina, amino ácidos o ácidos orgánicos) presentan un destino ambiental mucho más benigno, lo que ha señalado el camino a seguir para alcanzar disolventes iónicos más verdes y sostenibles. De hecho, algunos autores han sugerido que los productores farmacéuticos y cosméticos son cada vez más conscientes de que la sostenibilidad de sus procesos está fuertemente influenciada por la naturaleza (verde o no) de las sustancias empleadas en sus líneas de producción, lo que parece sugerir un mercado prometedor para disolventes construidos con tales compuestos naturales. La colina (Ch por sus letras iniciales en inglés) es quizás el catión más estudiado para conformar ILs basados completamente en biomateriales. Esta sustancia es conocida en biología molecular debido a sus múltiples efectos positivos en el metabolismo (vegetal, animal o incluso humano) y es considerado como un tipo de vitamina B desde 1998. Probablemente debido a la presencia ubicua de la Ch en distintos tipos de organismos los ILs basados en este catión suelen ser fácilmente biodegradables y presentar baja o nula toxicidad. Además, la Ch (i) es un núcleo catiónico mucho más barato que otros que dan nombre a las familias de IL más utilizadas, (ii) su proceso de producción industrial es sencillo y (iii) la síntesis de ILs a partir de soluciones alcalinas de Ch (por ejemplo, ChOH) es un proceso simple. Por todo esto, la Ch parece ser una alternativa atractiva para desarrollar disolventes y/o procesos más verdes. Sin embargo, el anión empleado puede llegar a ser decisivo en el destino ambiental del IL final. En ese sentido, en el año 2007 el Dr. Ohno presentó una de las familias aniónicas más utilizadas y estudiadas hoy en día para combinar con la Ch: los amino ácidos (AA). Los AA son las unidades básicas de construcción de las proteínas y algunos de ellos son de hecho nutrientes esenciales para los seres humanos. Probablemente debido de nuevo a su origen natural, los AA son considerados como aniones “verdes” y, como podría esperarse, los ILs basados en ChAA han resultado ser menos tóxicos y más biodegradables que muchos otros disolventes, siendo especialmente más adecuados ambientalmente que la mayoría de las familias más famosas de ILs. Junto a las diversas aplicaciones que ya han sido descritas para estos compuestos, el destino ambiental benigno de los ChAA apunta a un futuro prometedor para estos disolventes verdes. Todo esto ha motivado que el presente proyecto de Tesis haya sido enfocado al estudio de los ILs basados en ChAA, con el fin de explorar, perfeccionar, aplicar y en definitiva hacer esta tecnología más atractiva para su uso industrial. En ese sentido, existen varias carencias en la literatura cuyas respuestas pueden ser relevantes para alcanzar este objetivo. Primero, pese a que los estudios abordando la biodegradabilidad de la Ch están basados en ensayos estándar altamente aceptados por la comunidad científica, éstos no están exentos de controversia: (i) estos procedimientos no suelen considerar las matrices complejas (por ejemplo la presencia de una alta concentración de materia orgánica más fácilmente degradable que el contaminante objetivo) que suelen encontrarse en las estaciones depuradoras de aguas residuales y (ii) que la sustancia sea fácilmente degradable no significa que no pueda generar efectos negativos una vez vertida en el medio ambiente. Por lo tanto, desarrollar procesos de remediación que puedan ser utilizados por el propio generador de residuos puede resultar crucial para la implementación industrial de este tipo de compuestos. En ese sentido, hasta donde sabemos, no existen trabajos anteriores a este proyecto de Tesis que aborden métodos de remediación biotecnológica para la Ch. Esto ha motivado el primero de nuestros objetivos: demostrar la biodegradabilidad industrial de la base de síntesis de los ChAA, la Ch. Segundo, desde que se describieron los primeros ChAA en el año 2007 únicamente se investigaron la combinación de los 20 AA naturales y el citado catión, lo que no supone avance relevante alguno en esta tecnología. Sin embargo, en el momento de plantear el presente proyecto, nuestro grupo de investigación acababa de sintetizar novedosamente la segunda generación de estos disolventes: aniones basados en dipéptidos (2Pe) en lugar de AA simples. Este nuevo concepto parece suponer una revolución para el diseño racional de los IL de ChAA ya el número de disolventes posibles para de los 201 sintetizables con AA naturales a los 202 con 2Pe. No obstante, los residuos utilizados para conformar los dipéptidos aniónicos estaban construidos con glicina (Gly), el AA más sencillo, y con otro residuo de poco a medianamente funcionalizado. En base a esto cabe plantearse la siguiente pregunta, ¿podrían utilizarse 2Pe más complejos y funcionalizados o incluso tripéptidos para conseguir una sal de Ch líquida a temperatura ambiente? Dado que explorar los límites de síntesis racional de los ChAA podría incrementar su atractivo industrial, responder esta pregunta se convirtió en el segundo objetivo de la presente tesis. Sin embargo, consideramos que los nuevos ILs sintetizados también deben mostrar su aplicabilidad a procesos en el marco de la química verde para ser capaces de llamar la atención del sector industrial. En esta línea, los sistemas acuosos bifásicos (ABS por sus siglas en inglés) parecen una plataforma adecuada para alcanzar este fin: los ABS son un tipo de equilibrio líquido-líquido (L-L) basado en la inmiscibilidad que aparece en una disolución acuosa de dos compuestos hidrosolubles a partir de ciertas proporciones y se ha argumentado que debido a su naturaleza principalmente acuosa son sistemas más adecuados (biocompatibles) para la recuperación de biomoléculas y bioestructuras (como células u orgánulos) que las etapas L-L que usan disolventes orgánicos tradicionales. Los ABS conformados con ILs biocompatibles podrían emplearse para procesos de downstream en distintos ámbitos. De todos ellos, (i) el gran potencial de las microalgas para producir compuestos de alto valor como antioxidantes naturales, (ii) el atractivo de este tipo de antioxidantes para la industria farmacéutica, cosmética y nutricional y (iii) trabajos recientes de nuestro grupo de investigación abordando el procesamiento de microalgas mediante ABS, han abogado por que en este proyecto de tesis doctoral apostemos por usar ABS construidos con ILs de ChAA para la biorefinería de microalgas. No obstante, durante el desarrollo de la temática anterior, la idea de combinar varios ABS y formar un sistema acuoso trifásico (A3PS por sus siglas en inglés) surgió de manera natural. Un análisis de la bibliografía disponible demostró que tal fenómeno, sistemas acuosos multifásicos (AMPS por sus siglas en inglés), ya habían sido previamente publicados. Varios autores demostraron que para obtener n fases acuosas son necesarios n compuestos (sin contar el agua) capaces de generar n ABS ternarios entre sí. Sin embargo, en ninguno de estos trabajos se definió completamente un diagrama de fase de estos sistemas ni se determinó la influencia de los ABS constituyentes en el sistema multifásico final. Por lo tanto, (i) revelar el funcionamiento de este tipo de equilibro y (ii) determinar qué rol desempeñan los ILs de ChAA en la formación de A3PS podría demostrar el atractivo de estos disolventes verdes para diseñar un nuevo tipo de etapa de separación biocompatible. Consecuentemente, éstos se convirtieron en los últimos objetivos de sección de Aplicación de la presente tesis. La Figura R.1 presenta gráficamente (i) las tres temáticas que sustentan el presente proyecto de Tesis (Biodegradabilidad, Síntesis y Aplicación), (ii) los hitos (objetivos) específicos a alcanzar para cada temática y (iii) los artículos en los que se han estructurado estas investigaciones. En este proyecto de tesis se abordó inicialmente la temática de Biodegradabilidad y, tras ello, las secciones de Síntesis y Aplicación se diseñaron de manera conjunta, con el fin de demostrar la utilidad de la tecnología ChAA para realizar un diseño racional de procesos de separación biocompatibles. En la primera etapa de la temática Biodegradabilidad (Artículo 1), se orientaron los esfuerzos hacia la búsqueda de microorganismos capaces de consumir el catión Ch, con el fin de encontrar un agente capaz de ser empleado en un proceso de remediación útil industrialmente. En esta línea, varias cepas se sometieron a dos tipos de ensayo de biodegradabilidad modelo, un OECD normalizado (modificado para cultivos axénicos) y otro basado en un montaje biotecnológico típico (cultivo en frasco Erlenmeyer). Estos ensayos revelaron que sólo un microorganismo halotolerante (Staphylococcus equorum AMC7) y especialmente otro halófilo (Halomonas sp. LM1C) son capaces de degradar el catión Ch en el medio acuoso empleado (medio mineral mínimo o MMM). Halomonas sp. resultó ser el microorganismo más prometedor para desarrollar el proceso deseado debido a su rápido consumo de Ch y los altos niveles de mineralización sugeridos por las distintas técnicas analíticas empleadas. Consecuentemente, los estudios con esta cepa continuaron. Figura R.1: Esquema de las temáticas principales de esta Tesis doctoral, los hitos a alcanzar en cada una y los artículos publicados en donde se recogen las investigaciones correspondientes. El siguiente paso consistió en evaluar la capacidad de escalar la biomasa desde cultivos con inóculo diluido (Artículo 1). Para ello se evaluó la cinética de crecimiento en matraz del microorganismo empleando distintos modelos de fuentes de carbono. También se incluyó la Ch (contaminante objetivo) en este estudio para fines comparativos. Sorprendentemente, la Ch resultó ser la fuente de carbono más eficiente (más g de biomasa producida por g de nutriente). Sin embargo, la curva de crecimiento microbiológico con este contaminante presenta una pequeña fase de latencia no observable en otras fuentes como los tensioactivos no iónicos de la familia de los polisorbatos (Tween). En ese sentido, mientras que la Ch (y por lo tanto el mismo efluente contaminado) puede emplearse directamente en la obtención de biomasa necesaria para poner en funcionamiento los biorreactores industriales, los surfactantes Tween pueden usarse como activadores que estimulen el consumo de Ch por parte de la Halomonas sp. y por lo tanto como “aceleradores” del proceso. Con esta configuración, un inóculo diluido estimulado con Tween (20 o 80) tarda sobre 72 h en crecer y consumir de 2.5 g/L de Ch, mientras que si esta biomasa obtenida se emplea en un segundo lote para degradar la misma concentración de contaminante únicamente se necesitan 24 h para alcanzar el mismo nivel de remediación. Una vez se halló el microorganismo más prometedor y se estudió el proceso a escala matraz se procedió con los estudios preliminares de escalado a biorreactores funcionando en modo discontinuo. Inicialmente se abordaron las configuraciones de “tanque agitado” y “air-lift”, ambos para cultivos libres (resultados no publicados en revista científica). La comparativa de los datos sugiere que la agitación juega un papel fundamental en la activación del microorganismo y, pese a que se alcanzan tiempos de remediación mayores a los observados en escala matraz, los resultados son positivos y demuestran que Halomonas sp. es capaz de ser utilizado en reactores industrialmente utilizables. Por otro lado, y debido a las ventajas operacionales y versatilidad que presentan los cultivos inmovilizados para trabajar tanto en continuo como discontinuo, también se investigó el escalado de proceso de remediación a una configuración de “reactor de lecho fijo” mediante el atrapamiento del microorganismo en esferas de hidrogel (Artículo 2). Las matrices de hidrogel estudiadas resultaron no presentar impedimentos notables a la difusión de la Ch, lo que podría haber limitado la viabilidad del proceso. De las bases poliméricas estudiadas, los hidrogeles de alginato fueron los que atraparon más eficientemente las células de Halomonas sp, pese a que su incompatibilidad con tampones fosfato dio lugar a problemas con el control del pH del medio durante los procesos de remediación posteriores. En cualquier caso, los ensayos de remediación a escala matraz devolvieron resultaros prometedores y el escalado al reactor de columna demostró que pueden remediarse 2.5 g/L de Ch en menos de 48 h mediante un lecho fijo de microorganismo inmovilizado. Como se indicó anteriormente, las temáticas de Síntesis y Aplicación están íntimamente relacionadas en ILs debido a que un diseño racional de sus propiedades puede ser crucial para su desempeño en la aplicación deseada. En ese sentido, la selección de los residuos de AA que conforman el anión surge de los requerimientos del proceso propuesto para la biorefinería de microalgas. Primero escogimos el residuo fenilalanina (Phe por sus siglas en inglés) para (i) investigar la formación de ILs con 2Pe altamente funcionalizados (PhePhe) y (ii) obtener ILs en base Ch más apolares capaces de generar ABS prometedores con disoluciones acuosas de sales inorgánicas (Artículo 3). En la misma línea, el residuo de glicina (Gly por sus siglas en inglés) se empleó para (i) conformar el primer disolvente iónico basado en un 3Pe (GlyGlyGly) y (ii) evaluar la capacidad de los ILs hidrofílicos formados de Ch y aniones de Gly (ChGly, ChGlyGly y ChGlyGlyGly) para generar ABS con diferentes tensioactivos en disolución (Artículo 4). Una vez que las distintas técnicas de resonancia magnética nuclear (NMR por su siglas en inglés) confirmaron la síntesis correcta de cada IL, los análisis termogravimétrico y de calorimetría diferencial de barrido (TGA y DSC respectivamente por sus siglas en inglés) demostraron que los nuevos disolventes son líquidos hasta al menos -80 ºC y que su estabilidad térmica dinámica llega a cerca de los 200 ºC, lo cual supone un rango de uso amplio e industrialmente atractivo (Artículo 3 y Artículo 4). Finalmente, se realizó un análisis económico preliminar que ilustra cómo los disolventes de ChAA no son sólo más adecuados medioambientalmente que algunos ILs convencionales (como los imidazolios), sino que también son generalmente más baratos, lo que sugiere que son candidatos más prometedores para desarrollar nuevos procesos industriales. Con el fin de abordar la aplicación de los nuevos ILs biocompatibles a la biorefinería de microalgas, se propuso un “proceso simultáneo de lisis celular y recuperación de biomoléculas” basado en ABS conformados con estos disolventes. Primero, se evaluó la capacidad de los ILs de ChAA para (i) generar ABS con sales inorgánicas (Artículo 3) y tensiactivos (Artículo 4) y (ii) lisar la microalga modelo Tetraselmis suecica (Artículo 3 y Artículo 4). Los resultados obtenidos se compararon con los demostrados por el imidazolio hidrofílico modelo 1-etil-3-metil-imidazolio metilsulfato (C2C1ImC1SO4). En lo que concierne a la generación de ABS, la tuneabilidad de los ILs de ChAA demostró que los disolventes de esta familia (i) pueden alcanzar un desempeño como promotor de fases más hidrofóbico ligeramente superior al mostrado por el imidazolio modelo y (ii) que en general son mucho mejores agentes de segregación hidrofílicos que los imidazolios. Por otro lado, la capacidad lítica de los ChAA, especialmente la de los nuevos ChPhePhe y ChGlyGlyGly, parece ser superior a la mostrada por el C2C1ImC1SO4. Teniendo en cuenta la estructura de la microalga empleada, de acuerdo a la información suministrada por las distintas técnicas de microscopía y en la línea de resultados recientemente publicados por otros autores, parece que (i) la capacidad de establecer enlaces tipo puente de hidrógeno de los ChAA puede debilitar la estructura celulósica de la pared celular de la T. suecica, (ii) los dominios más apolares de estos disolventes son capaces de interaccionar y en última instancia romper su membrana celular (principalmente bi-lipídica) y (iii) la gran fuerza iónica de disoluciones concentradas de ILs puede favorecer los mecanismos anteriores a través de una importante presión osmótica que incluso podría llegar a generar por sí misma un fenómeno plasmolítico. El siguiente paso fue estudiar la partición de antioxidantes naturales en los ABS conformados los ILs más prometedores (Artículo 3 y Artículo 4). Los experimentos en este “sistema modelo” demostraron (i) la importancia de la recta de reparto (TL por sus siglas en inglés) escogida para solubilizar los antioxidantes hidrofóbicos estudiados en las fases acuosas ricas en IL y (ii) el rol crucial del pH del ABS en la estabilidad de algunas de las familias de biomoléculas estudiadas. Finalmente, una vez seleccionadas las condiciones operacionales más adecuadas, se simuló el proceso simultaneo de lisis celular y recuperación de biomoléculas introduciendo directamente la biomasa algal en los ABS escogidos. (Artículo 3 y Artículo 4) Los rendimientos de extracción obtenidos (cuando pueden compararse) sugieren que (i) la etapa de proceso propuesta tiene un desempeño en el mismo rango que el de la única estrategia similar (secuencial) basada en ABS publicada previamente y que (ii), cuando se compara con otras técnicas de recuperación, el tratamiento simultáneo en ABS parece un enfoque competitivo para el procesamiento de microalgas. Para finalizar la sección de Aplicación de los ILs basados en ChAA, y con ello también el presente proyecto de Tesis, se abordó la definición completa de cada una de las regiones cuaternarias de un A3PS (trifásica, bifásica, monofásica y de sólidos). Mediante la descripción de este sistema se buscó desentrañar (i) la relación de los ABS ternarios con cada una de las citadas regiones y (ii) el rol de los nuevos disolventes biocompatibles en la formación de este complejo equilibrio. Este estudio demostró que los ABS constituyentes efectivamente influyen en la amplitud, localización y forma de cada una de las regiones cuaternarias. De hecho, la región trifásica parece surgir de una conjunción de inmiscibilidades ternarias que puede ser estimada mediante la degeneración de cada uno de los ABS hacia su correspondiente línea o punto crítico (normalmente en dirección al eje acuoso binario contrario). En ese sentido, cuando uno de los ABS es notablemente más pequeño que el resto, éste parece convertirse en el “ABS limitante” que define principalmente el volumen trifásico del sistema. Por otro lado, los datos sugieren que una descripción adecuada de las TL de los ABS laterales también puede ser empleada para estimar cómo se distribuye el agua en las superficies de reparto de la región trifásica (TS por sus siglas en inglés). Cabe destacar que el hecho de que los ABS empleados fuesen suficientemente amplios (fases inmiscibles casi binarias) parece haber facilitado el proceso de establecer las relaciones anteriores. En este contexto, la naturaleza orgánica e iónica de los ILs estudiados hace que su habilidad para retirar agua (y por lo tanto generar ABS con distintos compuestos) esté en el medio de la que presentan las distintas familias de agentes promotores de fase estudiados (sales inorgánicas y surfactantes). En consecuencia, los ABS basados en estos disolventes son los que probablemente limiten la formación del equilibrio trifásico (“ABS limitante”) y por lo tanto un diseño racional de estos compuestos puede llegar a ser crucial para la obtención del A3PS más adecuado.