Presencia de melatonina en frutos de la dieta y bebidas fermentadas.Contribución al potencial antioxidante e implicaciones fisiológicas en el crecimiento y maduración de la manzana como modelo de estudio

Abstract

La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) es una molécula de bajo peso molecular con actividad biológica que aparece de forma ubicua en la naturaleza, habiendo sido detectada en organismos unicelulares, algas, hongos, animales y plantas. En animales se conoce bien su papel como neurohormona que ejerce acciones reguladoras de los ritmos circadianos y en la sincronización del reloj biológico. Asimismo, la melatonina se ha propuesto como un potente agente antioxidante que secuestra radicales libres y contribuye a la estabilidad celular. El conocimiento de la presencia de melatonina en plantas tuvo lugar a finales del siglo pasado y desde entonces se ha podido identificar esta molécula en un gran número de especies tanto de monocotiledóneas como de dicotiledóneas, así como en sus diferentes partes, incluyendo hojas, tallos, raíces, frutos y semillas. Además, el hecho de que la melatonina esté presente en plantas que forman parte habitual de la dieta, así como en productos derivados de las mismas, ha incrementado el interés por esta molécula, sobre todo en base a sus propiedades antioxidantes que podrían tener potenciales efectos beneficiosos para la salud. En este sentido, se han detectado cantidades importantes de melatonina en una amplia variedad de vegetales típicos de la dieta, tales como frutos secos, cereales, semillas, legumbres, hortalizas y frutas, por lo que la ingesta habitual de los mismos proporciona una fuente natural importante de melatonina al organismo. La presencia de melatonina en las plantas también ha generado una nueva corriente de estudios dirigidos a dilucidar su potencial fisiológico. Así, se ha propuesto una gran diversidad de funciones para la melatonina en plantas, incluyendo un papel regulador del crecimiento, habiéndose implicado en la regulación de varios procesos como la germinación de semillas, el crecimiento de la planta, la fotosíntesis, la senescencia o la maduración del fruto, además de afectar a las rutas biosintéticas de otras hormonas vegetales, como puede ser el etileno. Por otra parte, en base a sus propiedades antioxidantes se ha prestado atención al papel de la melatonina frente a las situaciones de estrés (biótico y abiótico) que provocan daño oxidativo a la planta, adjudicándosele a la melatonina un papel protector en estas situaciones. Los frutos se encuentran entre los alimentos mejor valorados y son ampliamente recomendados como parte fundamental de nuestra dieta diaria. Poseen un alto contenido de nutrientes, entre los que destacan proteínas vegetales, carbohidratos, vitaminas de los grupos A, B, C y E, así como en minerales tales como magnesio, potasio y calcio, incluyendo altas concentraciones de fibra vegetal. Además, los frutos son muy apreciados por la gran cantidad y diversidad de componentes antioxidantes que aportan, entre los que se encuentran las vitaminas (A, C y E), los polifenoles y los carotenoides. En el grupo de los polifenoles se incluyen antocianinas, flavonoides y ácidos fenólicos, todos ellos con gran capacidad para eliminar ROS y otros radicales libres. El interés por el conocimiento de los componentes bioactivos que pueden hallarse en frutos ha experimentado un aumento exponencial en los últimos años. En las dos últimas décadas también se han presentado numerosas evidencias de la presencia de melatonina en frutos y en algunos productos derivados tales como zumos, compotas o bebidas fermentadas, aunque dicho conocimiento es todavía escaso. Es por ello que en la presente Tesis Doctoral se decidió utilizar los frutos como elementos de estudio de la presencia de melatonina, así como su relación con otros componentes antioxidantes. Por otro lado, nos hemos interesado por conocer algunas de las posibles implicaciones fisiológicas de la melatonina en el fruto, en concreto en los procesos de crecimiento y la maduración. El conocimiento acerca del papel de la melatonina en la regulación de la maduración del fruto es escaso y los resultados existentes hasta la fecha son controvertidos, estimulando la maduración en algunos casos e inhibiéndola en otros, por lo que se hace necesario obtener evidencias en cada tipo de fruto. También existen pocos estudios que hayan abordado el papel de la melatonina en el crecimiento y desarrollo del fruto, así como durante la maduración post-cosecha, un proceso crucial para el mantenimiento de los parámetros de calidad del fruto que llega al consumidor. Por todo ello, el objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido caracterizar la presencia de melatonina en diferentes frutos que son habituales de la dieta humana y productos derivados de los mismos, prestando especial atención a su potencial antioxidante. Asimismo, se ha intentado dilucidar las implicaciones fisiológicas de la melatonina durante el crecimiento y maduración del fruto, utilizando la manzana como modelo de estudio. Estos objetivos se han abordado en una serie de trabajos experimentales cuyos resultados se comentan a continuación. En el Trabajo Experimental I nos hemos interesado por la presencia de melatonina en frutos secos. Para ello, se optimizó un método de extracción de melatonina en las muestras de frutos secos, haciendo especial hincapié en la nuez, así como su posterior cuantificación mediante HPLC con detección de fluorescencia. Además, se evaluó el contenido de melatonina en frutos secos en su forma natural y tras el procesamiento comercial (tostado), así como la influencia del grado de maduración del fruto (nuez). Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que los frutos secos presentan un alto contenido en melatonina, en particular en las nueces, en las que además se ha comprobado que el estadio de maduración del fruto altera sustancialmente dicho contenido. Asimismo, se ha demostrado que, en general, el procesamiento comercial (tostado) realizado comúnmente en frutos secos reduce el contenido de melatonina, lo que podría afectar negativamente a su potencial antioxidante. En el Trabajo Experimental II se propuso la caracterización de la presencia de melatonina y otras moléculas indólicas en el dátil, utilizando éste como modelo de fruto deshidratado. Además, se evaluó la contribución de estas moléculas a las propiedades antioxidantes en distintas variedades de dátil obtenidas en mercados locales. Los resultados revelaron la presencia de melatonina y de uno de sus isómeros, así como de otros indoles tales como la serotonina y el ácido-3-indol acético, en distintas variedades de dátiles comerciales. Estos compuestos presentan elevada actividad antioxidante, destacando en esta faceta el isómero de la melatonina y la serotonina, compuestos que están presentes en elevadas concentraciones en el dátil. El Trabajo Experimental III tuvo como objetivo estudiar el contenido de melatonina y compuestos fenólicos (fenoles y flavonoides) en un fruto carnoso como es la manzana, evaluando también su potencial antioxidante. Para ello, se analizaron diferentes manzanas comerciales, así como manzanas gallegas de origen autóctono, distinguiendo en este caso entre variedades catalogadas como manzanas de mesa y manzanas típicamente utilizadas en la industria sidrera. Asimismo, se determinó la presencia de melatonina en sidras comerciales y la capacidad antioxidante de ésta bebida. Los resultados obtenidos mostraron la presencia de la melatonina en todas las variedades de manzana estudiadas, aunque con diferencias sustanciales entre variedades comerciales y variedades tradicionales gallegas. En relación con estas últimas, las manzanas tradicionales de sidra fueron las que presentaron mayores niveles de melatonina, así como también una mayor capacidad antioxidante con respeto a las variedades tradicionales de mesa y las comerciales. Asimismo, se constató la presencia de melatonina en sidras comerciales embotelladas, caracterizándose también su capacidad antioxidante, lo que aporta un valor añadido a este producto. A fin de conocer cómo varía el contenido de melatonina durante la formación de la sidra, en el Trabajo Experimental IV se decidió estudiar la presencia y la evolución de los niveles de melatonina y de componentes fenólicos durante la fermentación de zumos de manzanas de variedades gallegas, hasta la obtención de la sidra final. Asimismo, utilizando zumos monovarietales de manzanas, se evaluó la evolución del contenido de fenoles y flavonoides durante la fermentación, así como también la capacidad antioxidante. Nuestros resultados mostraron la existencia de una síntesis activa de melatonina durante la fermentación del zumo de manzana para producir sidra, la cual está asociada a la actividad de los microorganismos (ej., levaduras del género Saccharomyces) que participan en dicho proceso y que usan el triptófano como elemento precursor inicial. Asimismo, en sidras monovarietales de manzanas tradicionales se ha constatado un alto contenido en fenoles y flavonoides en los mostos fermentados, el cual contribuye al poder antioxidante de las sidras finales. La manzana fue utilizada como modelo de estudio para conocer el papel fisiológico de la melatonina durante el crecimiento y maduración del fruto, un objetivo que se abordó en el Trabajo Experimental V. En sucesivos experimentos se evaluó el contenido de melatonina durante las fases de crecimiento y de maduración de la manzana, estudiándose también el efecto de tratamientos exógenos de melatonina durante la maduración de este fruto y su posible interacción con el etileno. Se observó que la evolución de los parámetros de crecimiento y maduración en manzanas de cultivo local, así como la síntesis de etileno, durante el periodo post-antesis mostró importantes diferencias entre las diferentes variedades de manzana estudiadas. En el caso de la manzana Golden, en la cual se realizaron los estudios relativos a la presencia de melatonina, se observó como el contenido de esta indolamina, así como uno de sus isómeros, variaba fuertemente durante el crecimiento y la maduración del fruto. Los mayores niveles de melatonina fueron detectados en la piel y durante la fase de maduración, coincidiendo con la máxima producción de etileno. En cuanto al tratamiento in vivo con melatonina sobre los manzanos, éste promovió la maduración del fruto al provocar un adelanto en la síntesis de etileno y un incremento general en sus niveles. Este efecto parece ser el mediador de los cambios que promueve la melatonina en las manzanas y que suponen un aumento del tamaño y del peso, así como de la firmeza del fruto, lo cual contribuye a la mejora de su calidad final. Finalmente, en el Trabajo Experimental VI se decidió abordar el estudio de la evolución de los parámetros de maduración post-cosecha en manzanas, evaluando el efecto de la melatonina sobre los mismos, así como su posible interacción con la síntesis del etileno. Además, se intentó conocer el efecto de la melatonina sobre el contenido de componentes fenólicos durante el proceso de maduración post-cosecha de la manzana. Los resultados obtenidos de este trabajo muestran como tras la cosecha, en la manzana se producen cambios muy fuertes en diversos parámetros de maduración que determinan el aspecto final del fruto y que variaron considerablemente entre las variedades de manzanas tradicionales incluidas en el estudio, como también lo hizo el patrón temporal de producción de etileno. Así, se puede concluir que en la manzana Golden, la producción climatérica de esta fitohormona está mediada por el aumento de la expresión de los genes MdACS1 y MdACO1, cuyos altos niveles en la piel, con respecto a la pulpa, podrían ser clave para el inicio de la maduración y el estallido climatérico. En este trabajo también se constató que el contenido fenólico (ácidos fenólicos, flavonoides y antocianinas) en la manzana es mucho más elevado en la piel que en la pulpa, variando de manera diferencial a lo largo del periodo de maduración post-cosecha. El perfil polifenólico también indica que la piel es un tejido más rico y con más variedad de estos componentes, entre los que destacan por sus niveles el ácido clorogénico, la floricina, la epicatequina y la procianidina B2. Además, la aplicación de un tratamiento con melatonina tuvo efectos estimuladores de los componentes polifenólicos y flavonoides, todos ellos con alta actividad antioxidante, lo que parece redundar de forma directa en la calidad del fruto y en sus potenciales beneficios para la salud. Por último, con los resultados obtenidos podemos deducir que el tratamiento con melatonina promueve la maduración del fruto de manzana durante el periodo post-cosecha por inducción de la síntesis de etileno, la cual es mediada, al menos en parte, por un incremento de la expresión de los genes MdACS1 y MdACO1. Asimismo, los cambios en la producción de etileno, conjuntamente con la acción estimuladora que la melatonina ejerce sobre los componentes fenólicos, podrían ser responsables de la mejora detectada en los parámetros de calidad del fruto maduro, con un incremento del color, el sabor y la firmeza, lo que en conjunto podría favorecer su conservación y su valor comercial.