Impact of tetracyclines on microbial communities in agricultural soils

Resumen

El descubrimiento de la penicilina por Alexander Fleming en 1928 marcó un antes y un después en la historia de la humanidad. El principal uso de los antibióticos era tratar enfermedades infecciosas y, por tanto, contribuyeron a que aumentase la esperanza de vida de la población mundial. Además, de su uso en medicina humana, también se comenzaron a usar en la ganadería para tratar a animales enfermos y como promotores del crecimiento. La creciente demanda de proteína animal a nivel mundial ha provocado un aumento en el consumo de estos fármacos en la ganadería, donde se estima que el consumo mundial es de entre 63,000 a 240,000 toneladas, sin embargo, se prevé un incremento de un 67% en 2030. A nivel mundial, China fue el mayor consumidor de antibióticos de uso veterinario, representando el 45% del uso mundial. Muy por debajo lo siguen Brasil (7,9%), Estados Unidos (7,0%), Tailandia (4,2%), India (2,2%), Irán (1,9%), España (1,9%), Rusia (1,8%), México (1,7%) y Argentina (1,5%)A nivel mundial, a partir de los datos revisados en la mayoría de países, las familias de antibióticos de uso veterinario más utilizados fueron las tetraciclinas seguidas de las sulfonamidas y macrólidos. Sin embargo, esta tendencia mundial no es la misma que la obtenida en Europa ya que los antibióticos de uso veterinario más consumidos fueron tetraciclinas (30,7%), penicilinas (28,8%), sulfonamidas (8,4%) y macrólidos (7,7%). Los antibióticos más usados en medicina veterinaria en España, según el informe JIACRA-ES elaborado en 2018, son las tetraciclinas (45,35%), seguidas de los betalactámicos (35,67%) y las polimixinas (8,5%).Las tetraciclinas son una familia de antibióticos constituida por un grupo de productos naturales y semi-sintéticos. Las tetraciclinas posen la misma estructura química, la cual consta de un núcleo con estructura tetraciclina lineal, compuesta de cuatro anillos fusionados. La suma de los diferentes grupos funcionales a la estructura química básica dará lugar a los numerosos compuestos que posee la familia. Las tetraciclinas son agentes de amplio espectro por lo que actúan frente a una gran variedad de organismos, tanto Gram positivos como Gram negativos. Estos antibióticos se difunden a través de la pared bacteriana y se fijan principalmente en un sitio de alta afinidad de la subunidad 30S del ribosoma bacteriano y algo menos en los sitios de baja afinidad de las subunidades 30S y 50S. De este modo, las ciclinas impiden la fijación del ácido ribonucleico (ARN) de transferencia bacteriano en el sitio aceptor (sitio A) y ejercen un efecto bacteriostático por cese de la traducción bacteriana.Los antibióticos del grupo de las tetraciclinas son los más utilizados en el sector agrícola, especialmente como promotores del crecimiento animal debido a que presentan una alta actividad farmacológica y solubilidad en agua. Además, están considerados como una de las clases de antibióticos actuales más baratos del mercado, lo cual los hace más atractivos en países que tienen presupuestos sanitarios más bajos. Dentro de la familia de las tetraciclinas, los antibióticos los más utilizados en todo el mundo son tetraciclina (TC), oxitetraciclina (OTC) y clortetraciclina (CTC). La tetraciclina, clortetracyclina y oxytetracyclina tienen propiedades físico-químicas muy similares. Esto antibióticos de tetraciclina son ácidos polipróticos con alta solubilidad en agua, relativamente estables en condiciones acidas, pero no alcalinas y con tres valores de pKa en el rango de 3-4, 7-8, y 9-10. Por lo tanto, las tetraciclinas son moléculas anfóteras que pueden existir en soluciones acuosas como catión (+00), zwitterion (+-0) y anión (+-- o 0--). Generalmente, las tetraciclinas son bipolares en la mayor parte del rango de pH ambiental del suelo (entre 3 y 8). Las tetraciclinas también forman quelatos metálicos de alta estabilidad, particularmente con iones metálicos divalentes, como calcio y magnesio.Estos antibióticos son mal metabolizados por el intestino de los animales y entre un 30 y 90% son excretados como compuesto original a través de las excretas animales. Los estiércoles son ampliamente utilizados como enmiendas orgánicas para suelos agrícolas, por lo que las repetidas aplicaciones de estos estiércoles sobre los suelos son una de las principales vías de entradas de antibióticos en los ecosistemas terrestres. Además, los antibióticos de tetraciclina son muy estables y persistentes en suelos y estiércoles debido a sus propiedades físico-químicas. Las concentraciones de tetraciclinas en los estiércoles varían en función de la especie animal, tipo de explotación ganadera y de la región geográfica de muestreo. Sin embargo, las tetraciclinas son los antibióticos reportados con mayor frecuencia en estiércoles y los que muestran las concentraciones más altas. Tras la llegada de los antibióticos a los ecosistemas terrestres, su comportamiento y destino están determinados por sus propiedades físico-químicas, las propiedades físico-químicas de los suelos y las condiciones meteorológicas. La persistencia de los antibióticos en el medio terrestre varía desde días hasta semanas e incluso meses ya que la persistencia en el medio está íntimamente relacionada con la concentración inicial del antibiótico en el suelo.Los antibióticos de tetraciclinas, una vez que alcanzan el suelo, pueden afectar a las comunidades microbianas del suelo y pueden causar cambios en la diversidad microbiana, influir en las actividades enzimáticas, funciones ecológicas del suelo e incluso en su estabilidad funcional. Los microrganismos del suelo desempeñan un papel fundamental en muchos procesos de los ecosistemas como el ciclo biogeoquímico de nutrientes y el reciclado de la materia orgánica. El correcto mantenimiento de la actividad biológica en los suelos se considera una característica clave para la productividad sostenible de los suelos y para garantizar las funciones de un ecosistema. Las propiedades microbianas del suelo pueden ser usadas como indicadores de calidad del suelo.Un elevado número de estudios han reportado el impacto de los antibióticos de tetraciclina sobre las comunidades microbianas del suelo. Estos estudios han mostrado resultados muy diversos en función de la propiedad microbiológica medida y el tipo de antibiótico de tetraciclina usado. Por tanto, es importante aclarar el efecto que causan las 3 tetraciclinas más ampliamente usadas actualmente a nivel mundial como son TC, OTC y CTC sobre las diversas propiedades microbiológicas del suelo. El empeoramiento de cualquiera propiedad microbiológica del suelo trae consigo la pérdida de calidad del suelo y por tanto disminuye la fertilidad y productividad de los suelos agrícolas.La alta persistencia de estos antibióticos, además de los cambios estructurales y funcionales sobre los microorganismos del suelo, también puede causar la aparición de tolerancias de las comunidades bacterianas del suelo a los antibióticos de tetraciclina. La resistencia a los antibióticos es la capacidad de una bacteria de sobrevivir y crecer en presencia de un antibiótico a una concentración a la que normalmente se inhibe su crecimiento. Cuando se utilizan antibióticos, existe una mayor posibilidad de destrucción de la mayoría de las bacterias susceptibles, y la supervivencia de las bacterias resistentes puede conducir a una mayor resistencia a los antibióticos y una mayor población bacteriana. El elevado uso de antibióticos de uso veterinario y concretamente de las tetraciclinas puede dar como resultado un aumento de las bacterias resistentes a antibióticos (ARB) y de genes de resistencia a antibióticos (ARG). Algunas bacterias son naturalmente resistentes a cierto tipo de antibióticos y otras bacterias adquieren resistencia a antibióticos por mutación genética o adquiriendo la resistencia de otra bacteria. La alta densidad de microbios en el entorno del suelo, generalmente, fomenta los intercambios genéticos, lo que podría mejorar el desarrollo de resistencia microbiana en presencia de antibióticos. El estudio del incremento de tolerancias a antibióticos de tetraciclina es de vital importancia ya que por transferencia genética horizontal los genes de resistencia pueden transmitirse a patógenos y afectar a la salud humana. Pese a la importancia de evaluar los efectos que causan los antibióticos de tetraciclina sobre las comunidades microbianas en suelos agrícolas, aún existe un gran desconocimiento sobre este tema y por tanto necesita un mayor estudio.Además, los antibióticos no son los únicos contaminantes que ejercen presión selectiva para generar incrementos de la tolerancia de las comunidades bacterianas a antibióticos, ya que procesos de co-tolerancia a antibióticos en presencia de otros contaminantes son posibles. Los metales pesados pueden estar presentes en elevadas concentraciones tanto en estiércoles como en suelos. Los metales pesados son tóxicos para la mayoría de los organismos cuando están presentes en concentraciones excesivas, siendo los microorganismos los más sensibles. Sin embargo, aunque los microorganismos son sensibles tanto a las deficiencias como a los excesos de oligoelementos, pueden adaptarse a altas concentraciones de estos elementos en su entorno. El efecto de los metales pesados sobre las comunidades bacterianas del suelo es un tema ampliamente estudiado. La toxicidad de los metales pesados sobre las comunidades bacterianas del suelo depende de las características físico-químicas de los suelos (como el pH y el contenido de carbono), las concentraciones de metales pesados añadidos, la forma en la que están presentes en el suelo y el período de incubación testeado. Sin embargo, la co-tolerancia de las comunidades bacterianas de los suelos contaminados con metales pesados a antibióticos de tetraciclina es un tema que necesita un mayor estudio.Una buena alternativa de bajo coste para prevenir los efectos dañinos de los antibióticos acumulados en el suelo, es el uso de subproductos/biadsorbentes como enmiendas del suelo. La enmienda de suelos con ciertos subproductos puede reducir la biodisponibilidad de diferentes tipos de contaminantes. Por tanto, el uso como enmienda de estos biadsorbentes puede que ayude a disminuir la toxicidad indeseable que causan los antibióticos sobre las comunidades bacterianas del suelo. Aunque existen diversos biadsorbentes probados eficazmente, en la presente Tesis Doctoral se han seleccionado la corteza de pino, concha de mejillón y ceniza de biomasa ya que estos subproductos son muy abundantes en Galicia y muestran una su gran versatilidad. El uso de estos subproductos como enmiendas del suelo puedo producir cambios en las propiedades físico-químicas de los suelos. El uso de concha de mejillón triturada (CMS) y ceniza de biomasa (BA) en los suelos causa un incremento del pH del suelo, por tanto, pueden ser utilizados como encalantes naturales. La adición de corteza de pino (PB) puede incrementar el contenido de materia orgánica de los suelos ya que este subproducto está compuesto por un elevado porcentaje de carbono orgánico.Para esta Tesis Doctoral se seleccionaron 22 suelos agrícolas de Galicia, provenientes de 2 zonas con una importante presión agro-ganadera (A Limia y Sarria), que fueron contaminados con 8 concentraciones crecientes (0, 0.5, 2, 7.8, 31.3, 125, 500 and 2000 mg kg-1) de TC, OTC y CTC. Tras la contaminación se les determinó el crecimiento bacteriano usando el método de incorporación de leucina marcada con tritio a corto, medio y largo plazo (1, 8 y 42 dias). Los resultados obtenidos muestran que los antibióticos de tetraciclina tienen toxicidad a altas concentraciones. Además, los antibióticos de tetraciclina son persistentes (OTC) o semi-persistentes en los suelos durante los 42 días de incubación. Las características de los suelos son puntos clave para la reducción de la toxicidad que ejercen los antibióticos sobre las comunidades bacterianas del suelo. Por tanto, para disminuir su toxicidad debemos incrementar los contenidos de materia orgánica y arcillas de los suelos. Sin embargo, los aumentos en el pH del suelo de valores ácidos a neutros aumentan la toxicidad de los antibióticos de tetraciclina. Observando la toxicidad que ejercen los 3 antibióticos de tetraciclina estudiados, CTC es el antibiótico que causa mayor toxicidad sobre las comunidades bacterianas del suelo, siendo estas diferencias significativas con respecto a TC y OTC. Sin embargo, entre TC y OTC no existen diferencias significativas entre sus toxicidades, por tanto, la secuencia de toxicidades de los antibióticos de tetraciclina es la siguiente: CTC >> OTC ≥ TC. Una vez observado los daños que causan TC, OTC y CTC sobre el crecimiento bacteriano de los suelos, se ha tratado de evaluar los cambios estructurales y funcionales que pueden sufrir en presencia de estos antibióticos. Para ello se seleccionaron 4 suelos y se contaminaron con diferentes concentraciones de antibióticos de tetraciclina y tras 42 dias se midieron 3 actividades enzimáticas (β-glucosidase, urease, and phosphomonoesterase), patrones de PLFAs y la biomasa microbiana total y específica. Las actividades enzimáticas mostraron una respuesta variable tras la adición de las diferentes concentraciones de los 3 antibióticos testeados. La β-glucosidase mostró un ligero incremento de su actividad que fue de mayor magnitud en suelo con menos materia orgánica. Sin embargo, la adición de TC, OTC y CTC inhibió la actividad ureasa, cuyo efecto fue mayor en el suelo con menor porcentaje en materia orgánica y para la máxima concentración de antibiótico añadida (2000 mg kg-1). Por último, en general la adición de antibióticos de tetraciclina al suelo no provoca cambios en la actividad fosfomonoesterasa. Atendiendo a la sensibilidad que muestran las actividades tras la adición de TC, OTC y CTC obtuvimos la siguiente secuencia: ureasa >> β-glucosidasa > fosfomonoesterasa. Por otro lado, los valores de patrones de PFLAs obtenidos se sometieron a análisis de componentes principales y se obtuvieron que está definido por el factor 1 y factor 2 que explican el 50% de la variación. Los resultados obtenidos permitieron mostrar la importancia de varias variables ambientales y estas se pueden clasificar con el siguiente orden: tipo de suelo >> antibiótico agregado (CTC, OTC o TC) >> dosis de aplicación.Por último, en cuando a la biomasa microbiana no se han podido obtener ninguna tendencia clara tas la adición de las diferentes concentraciones de TC, OTC y CTC, es decir, el efecto no fue dependiente de la dosis, y se pueden detectar comportamientos diferentes a dosis bajas, medias y altas. Además, lo valores de las relaciones biomasa fúngica/bacteriana y biomasa bacterias Gram-positivas/bacterias Gram-negativas, apenas variaron tras la adición de los antibióticos.Es de vital importancia conocer si la presencia de antibióticos de tetraciclina en los suelos agrícolas puede causar incrementos de tolerancia en las comunidades bacterianas del suelo y la evolución temporal de estas tolerancias. Para ello, se seleccionaron 2 suelos agrícolas con diferente contenido en materia orgánica (1.6 y 3.4%) a los que se le añadieron 8 concentraciones crecientes de TC, OTC y CTC (0, 0.5, 2, 7.8, 31.3, 125, 500 and 2000 mg kg-1) y se evaluó la tolerancia de las comunidades bacterianas a estos antibióticos a 45, 100, 180 y 365 dias de incubación. La determinación de la tolerancia a antibióticos se ha realizado usando el método PICT (tolerancia de la comunidad inducida por un contaminante) y con le técnica de incorporación de la leucina marcada con tritio. Los datos obtenidos muestran que solo existen incrementos de tolerancia en suelos contaminados con elevadas concentraciones de estos antibióticos (2000 mg kg-1), concentraciones que no se alcanzan en suelos agrícolas. Además, se muestra que existen picos de incremento de tolerancia entre los 45 y 100 dias de incubación, siendo la magnitud de los incrementos diferentes en el suelo con menor porcentaje de materia orgánica (1.6%) que en el que muestra mayor contenido de materia orgánica (3.4%), donde el incremento presenta menor magnitud. Al final del tiempo de incubación los incrementos de tolerancia descienden alcanzando valores en algunos casos similares a cero y en otros se mantuvieron más altos que en el control. Las presencias de otros contaminantes en el suelo son capaces de generar tolerancias de las comunidades bacterianas del suelo a antibióticos, como es el caso de los metales pesados. Para ello, se seleccionó un suelo agrícola que fue contaminado una elevada concentración (1000 mg kg-1) con 7 metales pesados (As, Cd, Zn, Cu, Ni, Cr and Pb) por separado y un suelo control. Tras 42 dias de incubación se evaluó la co-tolerancia de las comunidades bacterianas del suelo contaminadas con metales pesados a TC, OTC y CTC, usando el método de PICT. Los resultados revelan que las comunidades bacterianas del suelo contaminadas con concentraciones de metales pesados muy elevadas se vuelven tolerantes al propio metal y, además, también presentan co-tolerancia a los 3 antibióticos de tetraciclina testeados. Observado que existe co-tolerancia de diversos metales a altas concentraciones de metales pesados se trató de averiguar a partir de que concentración de metal pesado se volvían las comunidades bacterianas del suelo tolerantes al propio metal y co-tolerantes a los antibióticos de tetraciclina. Para ello se seleccionaron 3 suelos y se contaminaron con 5 concentraciones de Cu (125, 250, 500, 750 y 1000 mg kg-1) y el control, y tras 42 dias de incubación evaluó la tolerancia al Cu y co-tolerancia a TC, OTC y CTC usando el método PICT. Los resultados obtenidos muestran que existe incremento de tolerancia de las comunidades bacterianas del suelo a concentraciones entre 125 y 500 mg kg-1 de Cu y además existen co-tolerancias a concentraciones de Cu muy elevadas (1000 mg kg-1).Por último, es necesario implementar prácticas de manejo que ayuden a disminuir los efectos de los antibióticos de tetraciclina sobre los microorganismos del suelo. Para ello se han probado la adición al suelo de 3 desechos industriales muy abundantes en Galicia como son la corteza de pino (PB), la concha de mejillón triturada (CMS) y la ceniza de biomasa (BA) en diferentes dosis (0, 6, 12 y 48 g kg-1). Posteriormente, a las mezclas y suelo se contaminaron con diferentes concentraciones TC, OTC y CTC y se midió el crecimiento bacteriano del suelo tras 1 dia de incubación. La adición de PB a los suelos muestra 2 comportamientos diferentes en función de los antibióticos añadidos. Por una parte, la enmienda de los suelos con PB disminuye la toxicidad de TC (6-25%) y OTC (5-36%). Por el otro, la adición de PB al suelo apenas muestra disminución de la toxicidad de CTC o incluso incrementa su toxicidad tras su enmienda.La adición de BA a los suelos causa la disminución de la toxicidad de TC, OTC y CTC a dosis altas (24 o 48 g kg-1). La disminución de la toxicidad de los antibióticos sobre las comunidades bacterianas del suelo es muy variable ya que se observan reducciones del 5% a una recuperación total del crecimiento bacteriano (100%). Sin embargo, aunque PB y BA se consideran subproductos eficaces para reducir la toxicidad de los antibióticos de tetraciclina sobre el crecimiento bacteriano, CMS no resultó ser un subproducto muy eficaz. La adición de cualquier dosis de CMS no muestra un efecto positivo sobre la reducción de la toxicidad de TC, OTC y CTC.