Desarrollo de biomarcadores de metilación no invasivos para el cribado de cáncer colorrectal

Resumo

El cáncer colorrectal (CCR) representa una enfermedad heterogénea, que se desarrolla por la acumulación progresiva de alteraciones genéticas y epigenéticas a lo largo de la secuencia adenoma-carcinoma. Se han definido las vías de la inestabilidad cromosómica, de inestabilidad de microsatélites y de la neoplasia serrada como las responsables de la mayoría de casos de CCR esporádico. Alrededor del 70% de los CCR se desarrollan a través de la vía de la inestabilidad cromosómica, iniciada generalmente por mutaciones en APC y caracterizada por alteraciones somáticas en el número de copias. Por otra parte, el 15% de los tumores colorrectales presentan el fenotipo hipermutado propio de la vía de la inestabilidad de microsatélites. Por último, sobre el 15-30% de los tumores colorrectales progresan a partir de la vía serrada, la cual cuenta principalmente con mutaciones en el gen BRAF y con el fenotipo hipermetilador de islas CpG. Esta diversidad molecular y etiológica del CCR tiene implicaciones clínicas en cuanto al diagnóstico, localización del tumor, pronóstico y respuesta a terapia. El CCR supone un importante problema de salud pública, ya que es la tercera neoplasia en términos de incidencia y la segunda causa de muerte por cáncer a nivel mundial. La detección precoz de CCR en programas de cribado ha demostrado ser la estrategia más eficaz para reducir su incidencia y mortalidad. Sin embargo, la prueba no invasiva más utilizada en programas de cribado, el test de sangre oculta en heces inmunológico (FIT, por sus siglas en inglés fecal immunochemical test), presenta una sensibilidad inadecuada para la detección de lesiones precursoras del CCR, es decir adenomas avanzados (AA) y lesiones serradas de alto riesgo (HR-SL). Esta limitación, unida a la insuficiente tasa de participación en programas de cribado, pone de manifiesto la necesidad de una prueba no invasiva en sangre que pueda además aumentar la adherencia al cribado y mejorar la selección de los pacientes que deberán someterse a una colonoscopia diagnóstica. Los patrones de metilación aberrantes detectados en biopsia líquida, como en el DNA circulante libre de células (cfDNA) presente en suero, constituyen una fuente prometedora de biomarcadores no invasivos. El primer capítulo de este trabajo se centra en evaluar la viabilidad del uso de pooles de cfDNA de suero para el descubrimiento de biomarcadores de metilación no invasivos para la detección de neoplasia colorrectal avanzada (AA y CCR) mediante microarrays de metilación. Para ello se extrajo cfDNA de muestras de suero procedente de 20 individuos sin hallazgos colonoscópicos, 20 individuos con AA y 20 pacientes con CCR en estadios I y II. Se prepararon dos pooles para cada grupo patológico, mezclando la misma cantidad de cfDNA de 5 hombres y 5 mujeres, de mismo rango de edad y equilibrando el hospital de procedencia. Los niveles de metilación de 866 836 posiciones CpG a lo largo del genoma se cuantificaron mediante el microarray MethylationEPIC. La proporción de sitios CpG detectados en todos los pooles (>99%) superaron los estándares de calidad. Se identificaron 1384 posiciones diferencialmente metiladas entre individuos sin hallazgos colonoscópicos e individuos con neoplasia avanzada, las cuales presentaban más del 10% de diferencia entre los niveles de metilación. Los análisis de agrupamiento no supervisado demostraron que este perfil de metilación diferencial era capaz de distinguir las muestras de neoplasia avanzada, así como discriminar muestras de tejido de CCR y AA frente a mucosa sana, procedentes de un conjunto de datos externos. También comprobamos que los perfiles de metilación de AA y CCR en estadios I y II son homogéneos y se agrupan juntos. En conclusión, este estudio preliminar demostró la viabilidad del descubrimiento de biomarcadores de metilación a partir de pooles de cfDNA de suero, permitiendo aumentar la cantidad de cfDNA de partida, analizar mayor número de muestras y abaratar los costes de los análisis exploratorios. Esta estrategia no está limitada al descubrimiento de biomarcadores no invasivos para CCR, sino que es potencialmente aplicable a otros tipos tumorales. En el segundo capítulo de este trabajo llevamos a cabo el descubrimiento y validación de biomarcadores de metilación de cfDNA para el cribado de CCR en una cohorte multicéntrica de 433 muestras de suero compuesta por individuos sin hallazgos colonoscópicos, patologías benignas, adenomas no avanzados, AA y CCR. Primero llevamos a cabo un análisis de la metilación global mediante el microarray MethylationEPIC en 28 pooles de cfDNA para identificar biomarcadores candidatos, seguido de una priorización robusta de los biomarcadores mediante algoritmos de selección de variables. Por último, los biomarcadores seleccionados fueron validados mediante pirosecuenciación en una cohorte independiente de 153 muestras de cfDNA. Identificamos la metilación de GALNT9, UPF3A, WARS, y LDB2 como nuevos biomarcadores no invasivos para la detección precoz de AA y CCR mediante modelos de regresión logística. El modelo compuesto por GALNT9, UPF3A, WARS, y LDB2 demostró unos valores de sensibilidad y especificidad para la detección de neoplasia colorrectal avanzada del 62,1% y 97,4%, respectivamente. Por otra parte, la combinación de GALNT9 y UPF3A discriminó los casos de neoplasia avanzada con un 78,8% de sensibilidad y un 100% de especificidad. La relevancia clínica de la vía serrada de la carcinogénesis colorrectal se ha evidenciado en los últimos años. Sin embargo, el cribado efectivo de las lesiones serradas es, a día de hoy, una necesidad no resuelta. En el tercer capítulo de esta tesis doctoral caracterizamos el metiloma de cfDNA de suero de la vía serrada y evaluamos su potencial como fuente de biomarcadores no invasivos para la detección de adenocarcinomas serrados y de lesiones serradas de alto riesgo. Para ello contamos con una cohorte multicéntrica compuesta por casos de adenocarcinomas serrados, adenomas serrados tradicionales, lesiones serradas sésiles, pólipos hiperplásicos e individuos sin hallazgos colonoscópicos. Primero cuantificamos la metilación a lo largo de todo el genoma en 11 pooles de cfDNA e identificamos un perfil de metilación diferencial con capacidad de distinguir entre HR-SL y la ausencia de neoplasia. Este patrón de metilación diferencial fue comparado con el metiloma de tejido de adenocarcinoma serrado y de lesiones serradas sésiles procedentes de otros estudios, observando concordancia entre ellos. También evidenciamos que la vía convencional de CCR y la vía serrada presentan perfiles de metilación de cfDNA distintos, permitiendo la discriminación entre adenomas convencionales y lesiones serradas. Finalmente, evaluamos la utilidad de la metilación del cfDNA para el diagnóstico no invasivo de lesiones serradas mediante qPCR específica de metilación. De entre las regiones diferencialmente metiladas en HR-SL, la combinación de dos regiones localizadas en los genes NINJ2 y ERICH1 discriminan las lesiones serradas de alto riesgo y adenocarcinomas serrados con un 91,4% de sensibilidad y un 64,4% de especificidad, mientras que la metilación de una región localizada en el gen ZNF718 demostró el 100% de sensibilidad y el 96% de especificidad para la detección de adenocarcinoma serrado. Este es el único estudio hasta la fecha que ha explorado el metiloma de suero de la vía serrada de la carcinogénesis. Los biomarcadores de metilación en suero GALNT9, UPF3A, WARS y LDB2 identificados para la detección conjunta de AA y CCR, así como las regiones diferencialmente metiladas en lesiones serradas ubicadas en los genes ZNF718, NINJ2 y ERICH1, han demostrado una capacidad diagnóstica superior a la que presentan FIT y las pruebas CologuardⓇ (heces) y Epi proColonⓇ 2.0 CE (plasma) aprobadas por la FDA, y otros biomarcadores de metilación no invasivos evaluados en estudios previos. En resumen, nuestros resultados sugieren que los biomarcadores de metilación que identificamos en cfDNA de suero podrían suponer una nueva herramienta de cribado para la detección precoz de CCR, AA, adenocarcinoma serrado y lesiones serradas de alto riesgo en población de riesgo medio.