Vitrification of human oocytes employing a closed carrier with enhanced thermal efficiency and short times of exposure to synthetic cryoprotectant solutions

Resumen

La criopreservación consiste en la reducción de la temperatura del organismo, con el objetivo de detener de por completo la cinética de las reacciones biológicas que mantienen la homeostasis celular, y que al mismo tiempo provocan el envejecimiento de las mismas. Al arrestar el metabolismo celular, se logra la preservación del material biológico por tiempo indefinido. El principal problema asociado a la disminución de la temperatura de una célula para tal propósito es la tendencia a la cristalización del medio acuoso intracelular durante el enfriamiento. La configuración natural de los grupos de moléculas de agua dentro de las células es el estado desordenado propio del estado líquido. Sin embargo, el agua, al adquirir la estructura cristalina propia del hielo, se expande, dañando las estructuras biológicas y comprometiendo su viabilidad. La vitrificación es una transición de fase de segundo orden alternativa a la cristalización, en la que la solución acuosa adquiere propiedades de un sólido manteniendo el desorden natural de las moléculas de agua y solutos presentes en el citosol. Debido a que no se produce la reconfiguración molecular propia de la formación de hielo, permite mantener el sistema biológico que se pretende preservar sin alteraciones. Por lo tanto, para la criopreservación de material biológico, concretamente óvulos humanos en el caso de esta tesis, es necesario que el medio intracelular alcance el estado vítreo y se evite la formación de hielo, si no por completo, al menos cantidades lesivas del mismo. Existen diferentes estrategias para alcanzar el estado vítreo, pero en esta tesis nos centraremos en la técnica de vitrificación ultrarápida. Dicha técnica consiste en realizar el enfriamiento, desde la temperatura ambiente hasta temperaturas criogénicas estables (normalmente los -196 ºC del nitrógeno líquido), y posteriormente el recalentamiento, a altas velocidades. El gameto femenino —el óvulo— es la célula humana de mayor tamaño. Para su criopreservación en el contexto de la reproducción humana asistida, este se encuentra en un estado de arresto en la metafase de la segunda división meiótica, preparado para la fecundación. Su gran tamaño y la presencia de orgánulos muy sensibles hacen que su criopreservación sea compleja, comparada con la de embriones en los primeros días de desarrollo. Sólo mediante la técnica de vitrificación ultrarápida, sobre la que se trabaja en esta tesis, se consigue su criopreservación de forma satisfactoria. Durante un proceso de vitrificación ultrarápida, que se produzca o no la indeseada formación de hielo dependerá de las velocidades de enfriamiento y recalentamiento alcanzadas, y de las propiedades de la solución —en este caso el citosol, la fracción líquida intracelular. Con la concentración de solutos y viscosidad del citosol de los óvulos en su estado natural, las velocidades de enfriamiento y recalentamiento necesarias para evitar la formación de hielo serían muy difíciles de obtener. Por este motivo, es necesario aumentar la tendencia a la vitrificación del citosol, con un protocolo de preparación. Esta fase de preparación consiste en aumentar la concentración intracelular de solutos y la viscosidad del citosol, hasta un punto crítico que permita alcanzar la transición vítrea, a las velocidades de enfriamiento y recalentamiento obtenidas por los soportes de vitrificación actualmente disponibles. Para ello, el óvulo se expone a una serie de soluciones hipertónicas, que provocan la permeación de solutos hacia el interior celular y la salida de agua. Una vez concluida la preparación, el óvulo se coloca en un soporte de vitrificación —pajuela— y se procede al enfriamiento, por lo general por inmersión en nitrógeno líquido. En esta tesis se describen dos estudios prospectivos con óvulos de donante llevados a cabo en una clínica de fertilidad (Ginemed Sevilla), en los que se estudia la eficacia del sistema de vitrificación desarrollado por la spin-off de la Universidad de Sevilla Safepreservation, bajo la dirección científica del Dr. Ramón Risco. En el primer estudio, se emplea un kit soluciones de vitrificación cuya novedad es su composición totalmente sintética, sin la presencia de proteínas de origen humano como la albúmina, sustituidas por el polímero hidroxipropil celulosa. Este tipo de moléculas son generalmente empleadas como agentes surfactantes y también desempeñan actividad osmótica. Se comparan los resultados clínicos de un grupo de óvulos vitrificados con soluciones sintéticas frente a otro grupo de óvulos, proveniente de la misma donante, no sometidos a la vitrificación. Se comprueba que la alternativa desarrollada por el grupo de Risco obtiene unos resultados satisfactorios, similares a los obtenidos con soluciones de vitrificación clásicas que incorporan en su formulación proteínas de origen humano o animal, sin las desventajas asociadas a las mismas, como lo son el riesgo de contaminación y una vida útil reducida. En el segundo trabajo se emplea un diseño experimental similar al del primer estudio, para probar la eficacia del soporte cerrado de vitrificación SafeSpeed. El soporte está compuesto por un capilar ultrafino unido a una pajuela de resina ionomérica. El capilar donde se cargan los óvulos para la vitrificación permite maximizar las tasas de enfriamiento y recalentamiento, ya que la eficiencia térmica del mismo es ampliamente superior a la de otros soportes de vitrificación disponibles actualmente. Cabe resaltar también el hecho de que es un sistema cerrado, en el que las muestras biológicas no entran en contacto con el nitrógeno líquido empleado para el enfriamiento y la manipulación, minimizando el riesgo de contaminación por agentes patógenos presentes en el mismo. En este caso también comprobamos que las tasas de supervivencia ovocitaria al procedimiento de vitrificación con este soporte son excelentes, y que el desarrollo de los embriones resultantes de los óvulos vitrificados es similar al obtenido con óvulos que no han sido sometidos a la vitrificación. on estos resultados, queda patente que este sistema de vitrificación desarrollado en la Universidad de Sevilla es una herramienta muy efectiva que permite obtener resultados punteros en el contexto clínico. Sin embargo, los protocolos de vitrificación aún son susceptibles de mejora. A pesar de que el enfriamiento y el calentamiento de las muestras es ultrarápido, el procedimiento en conjunto requiere mucho tiempo, ya que el tiempo estándar para preparar cada grupo de hasta 3 óvulos para la vitrificación lleva de 10 a 15 minutos de exposición a soluciones hipertónicas. Es deseable una reducción de la duración de esta fase para mejorar el flujo de trabajo en el laboratorio de FIV y reducir el tiempo de exposición a crioprotectores potencialmente tóxicos. Con el objetivo de explorar esta posibilidad, decidimos estudiar la dinámica de la permeación de crioproctectores en el ovocito humano. En primer lugar, con una aproximación in silico, mediante un programa desarrollado en MatLab para integrar las dos ecuaciones diferenciales que describen la permeabilidad de la membrana plasmática del óvulo según un modelo 2-P. Estas simulaciones fueron complementadas con observaciones in vivo del comportamiento osmótico de los ovocitos. En un protocolo de preparación de óvulos para la vitrificación clásico, en primer lugar se realiza una exposición prolongada (10-15 minutos) del óvulo a una solución con una concentración intermedia de crioprotectores (≈25% w/w), denominada solución no-vitrificante o solución de equilibrado, seguida de una segunda exposición corta a una solución vitrificante (≈45% w/w). Comparamos la actividad osmótica que se produce en el protocolo estándar contra la de un protocolo corto, basado en la deshidratación, en el que la duración de la exposición de los óvulos tanto a la solución novitrificante como a la vitrificante era limitada a 60 segundos. Comprobamos que la deshidratación del óvulo tras la exposición a soluciones de vitrificación ocurre muy rápido; el punto de volumen mínimo de la curva de contracción y expansión resultante del gradiente smótico se alcanza dentro de los primeros 60 segundos. En ese punto, el contenido de agua intracelular es mínimo, la penetración de crioprotectores de bajo peso molecular es casi completa y, como resultado, la concentración total de soluto intracelular es alta. Por lo tanto, prolongar la primera fase de exposición hasta 15 minutos, según es recomendado en los protocolos actuales, no produce una mejora significativa de la tendencia a la vitrificación del citosol del ovocito, y no mejora presumiblemente sus posibilidades de vitrificar a determinadas tasas de enfriamiento y recalentamiento. Los resultados de las pruebas en óvulos humanos y embriones, no aptos para uso clínico y donados para la investigación, muestran que la tasa de supervivencia a la vitrificación no se ve comprometida por reducir los tiempos de exposición, confirmando que el efecto osmótico deseado se produce en un tiempo reducido. Las innovaciones en las técnicas empleadas para vitrificar las células reproductivas se rigen por la premisa de que se debe mantener un compromiso entre la seguridad y la eficacia; la técnica debe ser lo más aséptica y efectiva posible. Se podría argumentar que SafeSpeed, como soporte cerrado de virificación, cumple con este criterio de mejorar la eficiencia —eficiencia térmica, al menos— sin comprometer la seguridad, y como tal podría considerarse como un avance en la dirección correcta. Igualmente, el uso del polímero sintético hidroxipropil celulosa también representa una alternativa más segura y más estable a proteínas derivadas de humano o animal. Por último, lo mismo podría decirse sobre nuestros intentos de acortar el protocolo de vitrificación: si los ovocitos y embriones demuestran ser igualmente competentes, reducir la duración de la exposición a crioprotectores potencialmente citotóxicos y a temperaturas subóptimas debería ser más seguro. En última instancia, para cada modificación relevante del procedimiento, se debe realizar una ruta de validación bien diseñada antes de su uso en el contexto clínico, desde la etapa preclínica en modelos de mamíferos y material humano donado, hasta estudios clínicos prospectivos controlados.