Intrinsic and environmental influences on dna methylation and gene expression in fish

Resumo

Los mecanismos epigenéticos, influidos por factores intrínsecos y ambientales, son cruciales para la regulación de la expresión génica y, en última instancia, el fenotipo. La especie modelo que se utilizó fue la lubina (Dicentrarchus labrax), y con ella se estudió las influencias intrínsecas como, por ejemplo, la edad, los tejidos, el sexo y los antecedentes genéticos, y, por otro lado, los factores ambientales, tales como la temperatura y el entorno agrícola, en la metilación del ADN y el fenotipo durante el desarrollo temprano y en los adultos. El capítulo 1 se basa en la existencia de cambios en la metilación del ADN relacionados con la edad (Heyn et al., 2012; Jung and Pfeifer, 2015) y el reloj epigenético multi-tejido para estimar la edad biológica en los mamíferos (Horvath, 2013). En los peces se deconoce los cambios asociados de la metilación del ADN con la edad. Se utilizaron individuos de tres clases de edad para investigar el estado de metilación de un loci específico mediante la métodologia “Multiplex Bisulfite Secuencing” diseñada para este estudio. Identificamos CpG en ciertos loci exhibiendo disminuciones o aumentos de la metilación del ADN con la edad, lo que indica su utilidad como biomarcadores de la edad en los peces. Se sugiere un reloj epigenético en peces el cual puede tener implicaciones para los estudios en pesquerías y biología de la conservación. En el capítulo 2 se estudió el efecto de pequeños aumentos de temperatura, dentro de la magnitud pronosticada por los últimos modelos de calentamiento global (1-4ºC), en la metilación y expresión génica global del ADN durante el desarrollo. Se evaluó la metilación del ADN mediante el “Methylation Sensitive Amplified Polymorphism“ (MSAP) en las larvas criadas a regímenes de temperatura constante baja, media y alta, o bien sometidas a cambios de temperatura durante el desarrollo temprano, y a los juveniles sometidos a temperatura baja o alta al periodo tardío de desarrollo. El aumento de 2ºC en larvas alteraron significativamente la metilación global del ADN, mientras que un aumento de 4ºC en los juveniles no se observó efecto alguno. Los cambios de metilación global fueron más marcados en las larvas previamente aclimatadas a otra temperatura. Por lo tanto, las temperaturas moderadamente elevadas dan lugar a cambios que dependen del período de desarollo en la metilación global del ADN. En el capítulo 3 se estudiaron los efectos de los antecedentes genéticos, la temperatura y sus interacciones en un sistema de determinación de sexo poligénico con influencias de la temperatura (Piferrer et al., 2005; Vandeputte et al., 2007). La temperatura altera la metilación del promotor de la aromatasa gonadal en la lubina (Navarro-Martín et al., 2011) y otros genes implicados en el desarrollo sexual en el lenguado (Shao et al., 2014). Aquí, el estado de metilación del ADN de los genes implicados en el desarrollo sexual fue interrogado en la en progenitores conocidos por dar más o menos hembras, así como a su descendencia, que fue sometida a temperaturas bajas o altas durante el periodo termosensible. Los niveles de metilación del ADN fueron consistentes dependiendo del tratamiento de sexo y temperatura según la asociación de los genes con el desarrollo masculino o femenino. Además, el componente genético del sistema de determinación sexual influyó en la respuesta mediada epigeneticamente a la temperatura. En el capítulo 4 se investigó la regulación de la expresión génica por metilación del ADN en tejidos de diferente complejidad transcriptómica. Las evidencias recientes que se basan y amplían el modelo estándar de represión transcriptómica del gen por metilación del promotor (Bogdanović et al., 2016; Brenet et al., 2011; Long et al., 2013; Wan et al., 2015), se han basado principalmente en tejidos de especies modelo y líneas celulares. En este trabajo se utilizaron dos tejidos con alta y baja heterogeneidad celular, testículo y músculo, y se evaluaron los patrones genéticos de metilación del ADN mediante la “Reduced Representation Bisulfite Sequencing” (RRBS) y los patrones de expresión génica por secuenciación de ARN, para evaluar la asociación de las características de genes con patrones de expresión génica. Por primera vez en cualquier organismo, se mostró una clara relación inversa, cuasi-lineal, entre la metilación del primer intrón y la expresión génica a nivel genómico. Las regiones diferenciadamente metiladas específicas del tejido se encontraron también más concentradas en el primer intrón que cualquier otra característica génica. Estos hallazgos destacan la preeminencia de la región promotora y destacan la importancia del primer intrón en la regulación de la expresión génica. En el capítulo 5 se estudiaron los efectos de los primeros estadios de la domesticación utilizando un pez como modelo. Los animales domésticos comparten un conjunto de características fenotípicas conocidas por el nombre de el “síndrome de domesticación”, descrito por primera vez por Darwin. Recientemente se hipotetizó que el resultado del síndrome de domesticación proviene de alteraciones en el programa de desarrollo de células de cresta neural (Wilkins et al., 2014; Wright, 2015), pero falta un claro apoyo a esta hipótesis. Las posibles implicaciones de la metilación del ADN en los primeros pasos para la domesticación se estudiaron aquí utilizando peces salvajes y peces genéticamente similares criados en cultivo. Hubo diferencias en la metilación del ADN a nivel genómico asociadas con el ambiente de cultivo en ausencia de diferenciación genética. Las funciones de los genes asociados con estas diferencias se relacionaron con el desarrollo del sistema nervioso, incluyendo la migración, la diferenciación y el desarrollo de las células de cresta neural. Así, los primeros pasos para la domesticación incluyen alteraciones dinámicas en la metilación del ADN de los genes relacionados con la cresta neural y ésta es una de las primeras demostraciones empíricas en apoyo de la hipótesis de déficit de células de cresta neural para explicar el síndrome de domesticación de Darwin. En conjunto, estos resultados constituyen el análisis más integrador de los patrones de metilación del ADN en especies de peces en contextos intrínsecos y ecológicamente relevantes.