Estudi de l'efecte de l'entorn i de mutacions en l'estructura i estabilitat del receptor acoblat a proteïna G rodopsina

Abstract

La rodopsina és el fotoreceptor visual responsable de la visió a baixa intensitat lumínica que es troba en les cèllules bastó de la retina. Aquesta proteïna és el model per excellència de la superfamília de receptors acoblats a proteïna G (GPCR), que estan constituïts per 7 hèlices transmembrana, i que tenen un gran interès farmacològic. La rodopsina és lúnic membre de la superfamília lestructura del qual sha determinat per difracció de Raigs X. El seu estudi és de vital importància per determinar aquells motius estructurals comuns als GPCR, així com per contribuir a lelucidació dels trets bàsics dun mecanisme dactivació comú. A més, lestudi de mutacions en rodopsina associades a malalties de la retina com la retinosi pigmentària (RP) i la ceguesa nocturna congènita (CNC), ha de permetre determinar les bases moleculars daquestes patologies. Lobjectiu principal daquesta tesi és aprofundir en lestudi dels determinants estructurals de lestabilitat, així com també contribuir a desxifrar els mecanismes moleculars de la RP i la CNC. Per això sha estudiat lefecte de factors externs, com la unió de cations (en particular del zenc), i lestat de lentorn lipídic (alterant la concentració del detergent dodecil maltòsid) en lestabilitat de diferents estats de la rodopsina i del seu cromòfor. També sha determinat com afecten lestabilitat i la conformació de la rodopsina mutacions puntuals associades a la CNC, T94I, i a la RP, L46R; i a la xarxa electrostàtica present entre la part citoplasmàtica de les hèlices 3 i 6 mitjançant la construcció de mutants senzills, dobles i triples en les posicions 134, 247 i 251, els quals sha vist que estan implicats en el canvi conformacional de pas a la forma activa. Els mutants shan obtingut mitjançant tècniques de DNA recombinant, les proteïnes mutades shan expressat en cèllules COS-1, immunopurificat amb lanticòs monoclonal Rho-1D4, i caracteritzat per espectrofotometria UV-visible. Els resultats obtinguts demostren que el zenc suneix de manera específica a la rodopsina, disminuint la seva estabilitat tèrmica i la seva capacitat dunir 11-cis-retinal. També sha demostrat que la temperatura provoca la isomerització específica de l11-cis-retinal a tot-trans-retinal quan aquest es troba unit a rodopsina però no quan es troba lliure en solució. Això reforça la idea de la interacció òptima present entre els aminoàcids de la butxaca del retinal i el cromòfor. Pel que fa a lestudi de lefecte de lentorn lipídic en lestructura i estabilitat de la rodopsina, sha mostrat que elevades concentracions de detergent desestabilitzen la conformació activa (Metarodopsina II) però promouen la formació dun fotointermediari inactiu (Metarodopsina III). El detergent, doncs, juga un paper molt important en el desplaçament de lequilibri entre els diferents fotointermediaris. En el cas dels mutants associats a malalties de la retina, la mutació T94I disminueix lestabilitat de la conformació inactiva però estabilitza enormement la conformació activa, indicant un paper rellevant de la T94 en lestabilització duna xarxa electrostàtica en lentorn de la base de Schiff. La mutació L46R en la hèlix 1 i causant de la RP impedeix que la proteïna es processi correctament i arribi a la membrana. Aquest resultat posa èmfasi per primera vegada en la importància de lhèlix 1 per a lestructura de la rodopsina i probablement per altres GPCR. Lestudi dels mutants en les posicions 134, 247 i 251 en la part citoplasmàtica de les hèlices 3 i 6 ha confirmat que aquestes posicions són importants per a lestabilitat de la conformació inactiva de la rodopsina. Es proposa una paper central de la posició 251 en lestructura i lestabilitat de la xarxa eletrostàtica que implica aquestes posicions.