Regulació nutricional i endocrina de la lipòlisi i la lipoproteïna lipasa en la truita irisada ("Oncorhynchus mykiss") i l'orada ("Sparus aurata")

Resumo

En aquest treball sha posat a punt el protocol per a lobtenció dadipòcits aïllats de truita irisada ("Oncorhynchus mykiss") i dorada ("Sparus aurata"). Les preparacions obtingudes van mostrar una viabilitat adequada que va permetre lestudi de la lipòlisi i la captació de glucosa. La lipòlisi, mesurada com lalliberació de glicerol en el medi va augmentar proporcionalment amb el temps dincubació i la concentració cel.lular. El següent objectiu fou estudiar la regulació nutricional i el paper de la insulina i el glucagó sobre la lipòlisi dels adipòcits per amdues espècies. A més, en el cas de lorada es va analitzar el paper de lhormona de creixement i lefecte de dietes amb proteïnes de diferent origen. En la truita irisada, la insulina va disminuïr la lipòlisi dels adipòcits mentre que el glucagó fou lipolític. A més, el dejuni acompanyat duna hipoinsulinemia, així com la injecció de glucagó van incrementar la lipòlisi mesurada en adipòcits. De forma similar, la lipòlisi dels adipòcits dorades dejunades fou superior a la dels adipòcits dorades alimentades. En aquesta espècie, el glucagó i lhormona de creixement van estimular la lipòlisi mentre que la insulina no va tenir cap efecte. Finalment, els adipòcits dorades alimentades amb una dieta amb proteïna 100% dorigen vegetal van mostrar una lipòlisi més elevada que la dels adipòcits dorades alimentades amb una dieta amb proteïna majoritàriament procedent de farina de peix. El següent objectiu fou analitzar el paper del factor de necrosi tumoral alfa (TNF-alfa) sobre la lipòlisi dadipòcits de truita irisada. El TNF-alfa?va estimular la lipòlisi de forma dosi i temps depenent. Lefecte estimulador fou parcialment bloquejat utilitzant inhibidors de les MAP-quinases: MEK1/2 i p38 suggerint una implicació daquestes vies de senyalització. A més, adipòcits incubats amb medis de macròfags de truita irisada estimulats amb lipopolisacàrid (LPS) presentaren una lipòlisi més elevada que la dadipòcits incubats amb medis condicionats control. Finalment, ladminstració "in vivo" de LPS va provocar un augment de la lipòlisi en els adipòcits incubats 24 hores després de la injecció. En aquest temps, el LPS va inhibir significativament lactivitat lipoproteïna lipasa (LPL) en el teixit adipós. La segona part daquest treball es va concentrar en lestudi de la regulació nutricional i el paper de la insulina en lactivitat lipoproteïna lipasa en la truita irisida i lorada. En la truita irisada, lactivitat LPL va augmentar després de la ingesta en el teixit adipós però no en el múscul. Daltrabanda, el dejuni va produïr, en ambdues espècies, una disminució de lactivitat LPL en el teixit adipòs mentre que lactivitat no va variar en el múscul vermell. Ladminstració in vivo dinsulina va estimular lactivitat LPL en el teixit adipós a les 3 hores tant en truita irisada com en orada. En aquesta espècie, el canvi observat en lactivitat fou acompanyat per un augment dels nivells dARN missatger, tot i que aquest efecte no fou significatiu fins les 18 hores. En truita irisada, els estudis in vitro, amb trossos de teixit adipós, van mostrar com la insulina augmentava la proporció denzim LPL extracel.lular actiu. Finalment, es va establir la metodologia per a lestudi de la captació de glucosa en adipòcits aïllats de truita irisada. La captació de 2-deoxiglucosa va augmentar amb la concentració cel.lular i amb el temps dincubació. El transport fou inhibible per citocalasina B, indicant que la captació es dóna a través de transportadors de glucosa de difusió facilitada. La insulina i especialment el factor de creixement tipus insulina van estimular la captació de glucosa. Aquest efecte estimulador de la insulina fou totalment bloquejat per la wortmanina suggerint que la via de la PI3K/Akt és la principal via de senyalització implicada. " SUMMARY: In the present work, we have established the conditions for obtaining adipocytes of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and gilthead seabream (Sparus aurata). Lipolysis increased proportionally with cell concentration and incubation time. In rainbow trout, insulin decreased lipolysis while glucagon was lipolytic. Moreover, in both species, fasting and an "in vivo" injection of glucagon in rainbow trout increased lipolysis measured in adipocytes. In gilthead seabream, glucagon, growth hormone and diets rich in vegetal proteins were lipolytic. The next objective was to analyse the role of tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) on lipolysis of rainbow trout adipocytes. TNF-alpha?increased lipolysis in a dose and time dependent manner. Adipocytes incubated with supernatants of rainbow trout macrophages stimulated with lipopolisacarid (LPS) showed a higher lipolysis. The stimulatory effect of TNF-alpha was partially blocked using inhibitors of MEK1/2 and p38. Finally, adipocytes from LPS-injected rainbow trout showed higher lipolysis while lipoprotein lipase (LPL) activity in adipose tissue of LPS-injected fish was lower. The second part of this work was focused on the study of the regulation of lipoprotein lipase activity. In rainbow trout, LPL activity in adipose tissue increased in response to feeding, while in both species, fasting produced a down-regulation of LPL activity in adipose tissue, concomitant with low levels of insulin. Insulin administered "in vivo" produced an increase in LPL activity in adipose tissue in both species. In gilthead seabream, this increase in activity was acompanied by an increase in LPL mRNA while in vitro studies in rainbow trout, using fat pads, revealed that insulin stimulated the proportion of LPL in active conformation at extracellular level. Finally, we established the protocol for measuring glucose uptake in isolated adipocytes of rainbow trout. Glucose uptake increased with cell concentration and incubation time. Cytochalasin B inhibited glucose transport suggesting that glucose uptake is carried out by specific facilitative glucose transporters. Insulin and insulin growth factor-I stimulated glucose uptake in isolated adipocytes. This stimulatory effect of insulin was totally blocked by wortmanin suggesting that PI3K/Akt is the main intracellular signalling mechanism involved. "