Mecanisme d'activació de la Rodopsina i reconeixement molecular de la proteïna Gt

Resumo

La rodopsina (Rho) és el receptor visual responsable de la visió a baixa intensitat lumínica. Aquest receptor, que es troba en les cèllules bastó de la retina, està constituït per 7 hèlices transmembrana i és el prototip dels receptors acoblats a proteïna G (GPCR), degut a que és lúnic del qual sha resolt lestructura per difracció de raig X. Els GPCR tenen interès farmacològic ja que es troben involucrats en un gran nombre de processos fisiològics i patofisiològics. Lestudi estructural i funcional de la Rho ens ha de permetre determinar motius estructurals comuns en els GPCR, així com, elucidar el possible mecanisme molecular comú dactivació. A més, lestudi de mutacions de Rho associades a malalties com la retinosi pigmentària (RP) ens ha dapropar a les bases moleculars de la patologia. Lobjectiu principal daquesta tesi ha estat lestudi del mecanisme molecular dactivació de la Rho i la seva interacció amb la transducina. Per això, sha analitzat el paper estructural i funcional de les hèlices I i II de la Rho, així com el paper del retinal en el procés de fotoactivació del receptor. Per altra banda, també sha abordat la tasca de determinar quins aminoàcids poden estar implicats en lespecificitat de reconeixement de proteïna G. Shan estudiat les mutacions dadRP G51A, G51V i G89D, així com mutacions no naturals en aquestes posicions, per tal de determinar el paper de les hèlices I i II en lestructura i la funció de la Rho. La caracterització dels mutants de la posició 51 mostra que laugment de la cadena lateral de laminoàcid introduït provoca una disminució de lestabilitat de la conformació inactiva i també de la conformació activa (MetaII), que es pot relacionar amb la capacitat del receptor dactivar la transducina. Lestudi dels mutants de la posició 89 suggereix que en aquesta posició el que tindria importància seria la càrrega de la cadena lateral de laminoàcid. A més, els mutants G51V i G89D presenten un procés de fotoactivació anòmal, amb la formació dun fotointermediari alterat que es troba en equilibri amb la MetaII. El mutants G51V i G89D presentarien un desplaçament en lequilibri entre les conformacions MetaIa, MetaIb i MetaII cap al fotointermediari MetaIb, i aquest fet conjuntament amb la inestabilitat de la MetaII podrien ser els defectes moleculars que causarien RP. Per altra banda, la proteïna Wt va ser regenerada amb 11-cis-7-metilretinal (7 metil-Rho), amb la finalitat de determinar el paper del retinal en la fotoactivació del receptor. La proteïna 7-metil-Rho forma cromòfor de forma similar a Rho però presenta un procés de fotoactivació anòmal, amb la formació dun fotointermediari alterat que es troba en equilibri amb la MetaII. La introducció dun grup metil en el C7 del retinal provocaria canvis estructurals que afectarien la Met-207 i que farien que el receptor quedés atrapat en el fotointermediari MetaIa. Lequilibri existent entre les conformacions MetaIa, MetaIb i MetaII estaria controlat per una xarxa dinteraccions complexa entre les hèlices I, II i VII de la Rho i també per les interaccions entre la opsina i el retinal. També es van construir i expressar els mutants rodopsina-M3 de les nanses C-II i C-III. Aquests mutants presenten formació de cromòfor i un comportament en front la illuminació similar al de la rodopsina Wt. Els mutants simples de la nansa C-II presenten la mateixa capacitat dactivar la transducina que el receptor Wt a excepció del mutant V138S que presenta una activació de transducina reduïda a ligual que els mutants de la nansa C-III i que els mutants conjugats daquestes nanses. Cap dels mutants destudi presenta, però, un augment en lactivació de proteïna Giaq respecte al Wt. Els conjunt de resultats obtinguts suggereixen que els aminoàcids Val-138, Val-227, Val250, Val254 i Ile-255 de la Rho participarien en el reconeixement i/o activació de la transducina, i indicarien que les interaccions hidrofòbiques serien claus per la interacció Rho-transducina. ----------------------------------