Novas estratexias de biorrefinerías para a valorización de subprodutos de melón

Resum

Nos últimos anos, hai unha crecente preocupación pola perda e desperdicio de alimentos. Segundo as últimas estimacións, despois da colleita e durante o transporte perdéronse o 13,8% dos alimentos producidos en 2016 [1], mentres que os residuos ou fracción eliminada da cadea de subministro de alimentos humanos acadou o 17% en 2019 [2]. O total de perdas e residuos suma uns 1.300 millóns de toneladas globais cada ano, ou un terzo dos alimentos producidos, representando un alto custo económico, ambiental e social [3]–[6]. Polo tanto, o aproveitamento dos residuos alimentarios que non é posible previr nin reutilizar é fundamental para cumprir co obxectivo 12.3 de desenvolvemento sostible 2030 (SDG) sobre a redución de residuos e perdas alimentarias seguindo a filosofía de economía circular [7]–[9]. O procesamento industrial de froitas e verduras xera unha gran cantidade de residuos debido á súa alta fracción de partes non comestibles, susceptibilidade a danos e caducidade [4], [6], [10]. Non obstante, estes residuos conteñen compostos de alto valor engadido como antioxidantes, polisacáridos, enzimas, lípidos ou proteínas, que poderían ser aproveitados polas súas múltiples aplicacións industriais [6], [11], [12]. Por exemplo, o procesamento do melón (Cucumis melo) implica a separación das pelas e sementes, que representan o 25-44% e 2-15% do peso da froita, respectivamente, e teñen un alto contido en compostos bioactivos que normalmente non se aproveita [13]–[18]. O obxectivo principal desta Tese de Doutoramento é a valorización de subprodutos do procesamento do melón para a produción de compostos de valor engadido con propiedades multi-funcionais empregando tecnoloxías sostibles e innovadoras, en liña cos conceptos de economía circular e biorrefinería. O traballo levado a cabo durante a realización da Tese enmárcase dentro das liñas de investigación do Grupo EQ-2 Biomasa e Desenvolvemento Sostible, que pertence ao Departamento de Enxeñaría Química da Universidade de Vigo (Campus de Ourense). Para isto, obtivéronse subprodutos de melón, sandía, cabaza e piña, dunha industria local (FreshCut, S.L., Vigo, Pontevedra). A primeira tarefa desta Tese foi unha revisión bibliográfica sobre estas froitas, presentada no Anexo A, ademais da caracterización química dos subprodutos obtidos. En vista dos resultados, seleccionáronse os subprodutos de melón para continuar co traballo debido ao seu contido en pectina, á súa elevada produción e á escaseza de traballos realizados na bibliografía con esta materia prima. O melón é unha das froitas máis producidas e consumidas no mundo, sendo España o principal produtor de Europa [19]–[21]. Tendo en conta as cantidades producidas desta froita, a fracción de pelas e sementes dá lugar a uns 8-17 millóns de toneladas de subprodutos en todo o mundo, e 165-359 mil toneladas en España. As pelas, cun alto contido en humidade, están compostas principalmente por celulosa, hemicelulosas, pectina e proteína [22], [23], mentres que as sementes destacan polo seu contido en lípidos e proteínas [24]–[26]. Neste traballo, aproveitáronse os oligosacáridos de pectina, os compostos fenólicos e máis a celulosa dos subprodutos de melón. A celulosa, o principal compoñente das paredes das células vexetais, supón un 15-21% da pela de melón [22], [27]–[29]. Este polisacárido podería aproveitarse na elaboración de micro ou nano-celulosa, ou como substrato para a produción de bioetanol, biohidróxeno ou PHAs (polihidroxialcanoatos), entre outros [23], [30]–[34]. Por outra banda, a pectina, un heteropolisacárido constituído principalmente por ácido galacturónico, ten múltiples aplicacións nas industrias alimentaria e cosmética como estabilizador, emulxente, espesante ou axente xelificante, ademais de aplicacións máis novidosas como prebióticos, nutracéuticos, envases activos ou transporte de medicamentos [30], [35]–[38]. Varios traballos estudaron a extracción de pectina de pela de melón con rendementos entre 3,8 e 33% e contidos en ácido galacturónico de 41 a 93% [39]–[44]. As pelas de melón, coma as doutras froitas, teñen un interesante contido en antioxidantes, incluíndo fenois, vitamina C, carotenoides e clorofilas [16], [26], [45]. Varios traballos estudaron a extracción de compostos fenólicos de subprodutos de melón, que demostraron capacidade antioxidante e ata bioactividades anti-inflamatoria e anti-canceríxena [18], [46]–[48]. Algúns dos compostos fenólicos que se atopan nos subprodutos de melón son o kaempferol, a catequina, o ácido 4-hidroxibenzoico ou o ácido gálico [19], [46], [49]. Estes compostos antioxidantes teñen aplicacións nas industrias alimentaria e farmacéutica, como suplementos dietéticos, ingredientes alimentarios funcionais ou nutracéuticos [50]. Para a recuperación destes compostos dos subprodutos de melón, nesta Tese propuxéronse tratamentos de autohidrólise e de extracción sólido-líquido con mesturas eutécticas de baixo punto de fusión (DES), traballos que se presentan nos Anexos B e C. Tradicionalmente, o método de extracción máis empregado é a extracción sólido-líquido en medio acuoso ou con disolventes orgánicos, especialmente para a recuperación de compostos fenólicos. Para isto, úsanse disolventes como acetato de etilo, alcois ou auga [51]. Ao modificar o pH do disolvente pódese producir a hidrólise ácida ou alcalina, que se empregan habitualmente para a solubilización de proteínas e polisacáridos, e máis poden favorecer a recuperación de compostos fenólicos ligados e estas macromoléculas [51]–[56]. En particular, a pectina adoita recuperarse mediante extracción ácida con pH arredor de 1-2 [55], [56]. Cabe sinalar certos métodos físicos e fisicoquímicos, como ultrasóns, microondas ou líquidos presurizados, tamén moi estudados nestes últimos anos, xa que reducen o tempo de extracción e aumentan o rendemento [57], [58]. En concreto, a extracción con líquidos presurizados pode empregarse con auga como disolvente, manténdoa en estado subcrítico mediante a aplicación de temperatura e presión. Neste método, chamado tratamento hidrotérmico ou autohidrólise, a reactividade do disolvente ven dada polo aumento das concentracións de H+ e OH- ao romper os enlaces de hidróxeno e máis pola solubilización de ácidos orgánicos presentes na materia prima, sen precisar ningún reactivo químico externo [59]–[61]. A autohidrólise úsase con frecuencia para a solubilización de oligosacáridos de pectinas ou hemicelulosas, aínda que tamén pode liberar compostos fenólicos ligados a estas macromoléculas ou derivados da despolimerización da lignina [62], [63]. O traballo recollido no Anexo B trata sobre o uso de autohidrólise para a recuperación de oligosacáridos de pectina dos subprodutos de melón. Para isto, comezouse con unha extracción acuosa para separar os azucres solubles que senón se degradarían en tratamentos posteriores. Nesta etapa obtívose unha fracción líquida contendo azucres e ácidos orgánicos, representando o 42,21% da materia prima, e unha fase sólida insoluble en auga (WIS). Os extractos acuosos estaban formados principalmente por glicosa (36,40%), frutosa (45,79%) e proteínas (10,81%), mentres que o WIS se compoñía principalmente de glicano (24,54%), polímeros de ácido galacturónico, o composto principal da pectina, (11,99%), lignina (19,96%) e proteínas (11,36%). O WIS obtido do lavado someteuse a un tratamento de autohidrólise en réxime non isotermo, nun rango de temperaturas comprendido entre 130 e 165 °C, para conseguir a solubilización óptima de oligosacáridos de ácido galacturónico (OGalA). O contido en OGalA aumentou coa severidade do tratamento ata acadar o máximo a 150 °C, cun rendemento do 80,02% (g de OGalA/100 g de ácido galacturónico no WIS), diminuíndo ao incrementar máis a temperatura debido á despolimerización. As pequenas diferenzas entre os licores de 140 e de 150 °C non xustificaron o aumento de temperatura, polo que se seleccionou 140 °C como óptimo para o tratamento. Así, os oligosacáridos totais solubilizados foron 15,24 g/100 g WIS, dos que 10,07 g/100 g WIS eran OGalA, cun rendemento do 77,42%. Este rendemento foi maior aos atopados en bibliografía para pelas de laranxa e polpa de remolacha, e similar ao de pelas de limón, mentres que o contido en OGalA foi menor debido ao menor contido en pectina da materia prima [63]–[65]. Tamén se analizou o contido en fenois totais (TPC) e capacidade antioxidante dos extractos. Á temperatura seleccionada, os compostos fenólicos totais atopados foron comparables aos recollidos na bibliografía para extractos de pela de melón (1,89 mg GAE/g WIS vs 0,1-11,1 mg GAE/g materia prima) [16], [49], e nos tratamentos a temperaturas superiores conseguiuse aumentar este valor ata 8,96 mg GAE/g WIS. A capacidade antioxidante, determinada por DPPH, FRAP e ABTS, deu valores de 0,65, 0,83 e 7,52 mg TE/g WIS, respectivamente, para 140 °C e 3,19, 4,85 e 19,63 mg TE/g WIS para 165 °C. Ademais, para os extractos a 140 °C detectáronse e cuantificáronse algúns compostos fenólicos mediante HPLC-DAD-MS/MS: ácido 4-hidroxibenzoico (7,85 µg/g WIS), ácido salicílico (0.51 µg/g WIS) e ácido p-cumárico (0,12 µg/g WIS). Recentemente, disolventes verdes alternativos como os líquidos iónicos ou DES están a gañar terreo neste ámbito científico. En concreto, os DES presentan vantaxes como baixa presión de vapor, reciclabilidade, biodegradabilidade, baixo custo e fácil preparación [66], [67]. Ademais, as súas propiedades poden regularse mediante a selección dos compoñentes da mestura, e se estes compoñentes son metabolitos primarios das plantas, considéranse DES naturais ou NaDES [66]–[68]. Téñense usado DES para extraccións sólido-líquido de compostos fenólicos de subprodutos de froitas [69]–[71], e en menor medida para extraccións doutros compostos como pectina [70], [72] ou proteína [73]. Ademais, algúns estudos avaliaron o uso de DES ou NaDES xunto con tecnoloxías como ultrasóns [72], [74], microondas [75], [76] ou alta presión [76] para a recuperación de fenois ou pectinas. O Anexo C recolle o estudo realizado sobre a valorización dos subprodutos de melón mediante extracción con DES. Para este tratamento tamén se realizaron lavados previos con auga para separar os azucres solubles. Neste caso obtivéronse un 38,83% de extractos, con composicións similares ao traballo anterior para o licor e máis o sólido. Nunhas probas preliminares avaliáronse tres DES en condicións fixas: acetato de sodio:urea:auga 1:3:1,6, betaína:glicerol:auga 1:1:1,3 e cloruro de colina:urea 1:2. A mestura de acetato de sodio e urea (NaOAc:urea) demostrou un maior potencial para a recuperación de OGalA, compostos fenólicos e máis proteínas, polo que foi seleccionada para seguir co traballo. A continuación, empregouse o método “one factor at a time” (OFAT) para avaliar o efecto das seguintes variables: tempo de extracción (5-120 min), relación molar do DES (1:2, 1:3, 1:4), contido en auga (10-30%), consistencia en sólido (2-5%) e temperatura (80-90 °C). Con estes experimentos descubriuse que a extracción de OGalA está altamente influenciada pola temperatura de extracción, cun menor efecto do tempo, mentres que a solubilización da proteína está máis afectada pola relación molar do DES, e o contido en fenois depende principalmente da temperatura, o tempo e a consistencia. As condicións seleccionadas foron: NaOAc:urea:auga 1:3:1,6 (10% (p/p) auga), consistencia de 2% (p/p), a 90 °C durante 10 min. A extracción de OGalA a 90 °C foi case inmediata, atopando o óptimo aos 10 min cun rendemento do 67,65%, mentres que ao incrementar o tempo de extracción se produce a degradación dos oligosacáridos. En canto á proteína, obtívose un mellor resultado coa relación 1:4, con maior concentración en urea (3,47 g de proteína/100 g WIS aos 10 min), así como coa relación 1:3 cun maior tempo de extracción (3,80 g/100 g WIS aos 60 min). Non obstante, a maior parte da proteína recuperada solubilizouse xa aos 10 min coa relación 1:3, as condicións óptimas para o OGalA. Por outra banda, o contido en fenois totais (TPC) e a capacidade antioxidante foron maiores ao máximo tempo estudado (120 min, a 90 °C e con relación molar 1:3 e 10% de auga): TPC=9,99 mg GAE/g WIS, DPPH=2.82 mg TE/g WIS e ABTS=32.07 mg TE/g WIS. Aínda así, o TPC nas condicións seleccionadas (4,35 mg GAE/g WIS) foi algo máis do dobre que o obtido no óptimo de autohidrólise. Deste xeito, nas condicións óptimas obtívose un contido en oligosacáridos de 8.84 g OS/100 g WIS, dos que o 90% foron OGalA, e contidos en fenois totais e proteínas de 4.35 mg GAE/g WIS e 2.87 g/100 g WIS, respectivamente. A recuperación de produtos concentrados e libres de impurezas normalmente require dunha ou varias etapas de purificación para facilitar a caracterización e a súa futura aplicación. Algúns dos métodos empregados para purificar e fraccionar pectinas e oligosacáridos son a precipitación, a filtración con membranas, a diálise, a cromatografía e a adsorción [77]–[79]. O máis empregado é a precipitación en medio alcohólico, debido ao seu rendemento satisfactorio a baixo custe, aínda que tamén se pode precipitar pectina mediante enlace iónico ou complexos pectina-proteína, que son métodos máis selectivos [79]–[83]. A precipitación con etanol tense usado para recuperar pectinas extraídas de subprodutos de froita mediante hidrólise ácida, extracción con DES e authodrólise, entre outros [40], [84], [85]. Tamén se usou con pectinas de subprodutos de melón, empregando condicións fixas [39], [40], [42]. En canto á fracción fenólica, os métodos máis comúns para a súa purificación son a extracción líquido-líquido e a adsorción [86], [87]. Diferentes adsorbentes poliméricos macroporosos empregáronse para recuperar polifenois extraídos con diversos métodos, incluíndo DES e autohidrólise [88]–[92]. Durante a realización desta Tese, probáronse varios métodos para a purificación tanto dos licores obtidos por autohidrólise como dos extractos obtidos con DES: diafiltración con distintas membranas, precipitación, extracción líquido/líquido e adsorción con resinas. Para a separación da pectina seleccionouse a precipitación con etanol, pola súa eficiencia na recuperación de oligosacáridos. Este método empregouse nos traballos dos Anexos B e C usando condicións fixas baseadas na bibliografía [39], [40], [93]. Para os licores de autohidrólise a 140 °C (Anexo B) obtívose un rendemento 16,59 g de precipitado/100 g WIS cun contido en OGalA do 55,41%, usando unha concentración de etanol do 75%. Por outra banda, cos licores da extracción con DES (Anexo C) empregouse un 58% de etanol e obtívose un rendemento en pectina de 7,95 g/100 g WIS, cun contido en OGalA de 49,44%. Estes resultados están no rango dos atopados en bibliografía para extracción ácida ou acuosa asistida por microondas de pectina de pelas de melón: 3,8-33 g pectina/100 g de pela de melón, con contidos en ácido galacturónico de 41 a 93% [39]–[44]. En canto aos oligosacáridos neutros, atopouse un maior contido na pectina do traballo con DES (20,14 vs 13,07%). As diferenzas entre as dúas pectinas poden deberse ao pH básico do DES, xa que as extraccións alcalinas tenden a solubilizar pectinas máis ricas en azucres neutros, que ademais requiren unha maior concentración de etanol para precipitar [93], [94]. Para mellorar a recuperación das pectinas, realizouse outro traballo (Anexo D) cun lote novo de pelas de melón no que se avaliaron diferentes concentracións de etanol, ademais de estudar a recuperación dos compostos fenólicos mediante adsorción con resinas. O novo lote de pelas de melón deu lugar a un 39,95% de WIS con alto contido en glicano, galacturonano, lignina e proteína (24,76, 18,41, 15,70 e 9,70 g/100 g WIS). O WIS tratouse polos dous métodos propostos anteriormente, con certas modificacións, debido ás diferenzas atopadas na composición química do novo lote de materia prima. No caso da autohidrólise cambiouse a temperatura de tratamento a 165 °C, optimizando o contido total en OS, mentres que na extracción con DES se incluíu un lavado con auga posterior para aumentar a recuperación de OS. Así, o contido total de oligosacáridos foi de 18,55 g OS/100 g WIS para autohidrólise e de 11,30 g OS/100 g WIS para a extracción con DES; e o contido en fenois totais foi de 10,38 mg GAE/g WIS para autohidrólise e de 6,12 mg GAE/g WIS para a extracción con DES. Para a recuperación da pectina probáronse concentracións de etanol de 75, 80 e 85% (v/v). O aumento nas recuperacións de OS ao aumentar a concentración de etanol foi suficiente para xustificar o uso da maior concentración, obtendo uns rendementos en pectina de 16,11 e 18,05 g/100 WIS para os licores de autohidrólise e do tratamento con DES, respectivamente. O contido en ácido galacturónico destes precipitados foi de arredor do 45%, mentres que o de autohidrólise presentou un maior contido en azucres neutros debido á elevada temperatura empregada no tratamento. Ademais, as pectinas analizáronse por FTIR e HPAEC-PAD, confirmando a presenza de OGalA con grao de metilación baixo e graos de polimerización de 2 a 20. Para a recuperación dos compostos fenólicos do licor libre de pectina avaliáronse tres resinas diferentes (Amberlite XAD4, XAD16HP e XAD7HP), estudando o efecto da relación licor-resina (2, 6, 10 e 20 mL/g) e do disolvente para a desorción (diferentes concentracións de etanol e pHs). Coas condicións seleccionadas (adsorción: resina Amberlite XAD4, 120 min, 30 °C, relación licor/resina 2 (mL/g); desorción: etanol 50% (v/v), 20 min, 30 °C, relación disolvente/resina 3 (mL/g), 3 veces), recuperáronse arredor do 50% dos fenois totais presentes nos licores de autohidrólise e do 25% dos da extracción con DES, mantendo arredor dun 60 e 30% da capacidade antioxidante para os licores de autohidrólise e de DES, respectivamente. Os concentrados obtidos tiveron un contido en fenois de 79,55 e 4,08 mg GAE/g NVC (contido en compostos non volátiles) para os licores de autohidrólise e DES, respectivamente, ambos con capacidade antioxidante mellorada. Ademais, identificáronse e cuantificáronse algúns ácidos fenólicos (ácidos protocatecuico e ferúlico) e flavonoides (orientina, vitexina e narinxenina) nos produtos concentrados mediante HPLC-PDA-MS/MS. Por último, avaliouse a vía fermentativa para o aproveitamento da celulosa presente nos sólidos residuais dos tratamentos anteriores. Algúns dos produtos que se poden obter mediante procesamento microbiano son o bioetanol, o biohidróxeno, diferentes enzimas e ácidos orgánicos [95]. En concreto para subprodutos de melón, hai estudos que avaliaron a produción de bioetanol, biohidróxeno, biogás, celulasas e PHA [29], [32], [34], [96], [97]. Algúns traballos produciron bioetanol a partir dos azucres solubles en auga presentes nos residuos de melón [96], [98], mais ningún destes traballos aproveitou o contido en polisacáridos co mesmo fin. Neste contexto, para avaliar esta alternativa determinouse a composición química dos sólidos resultantes da autohidrólise e do tratamento con DES, e estudouse a viabilidade da hidrólise enzimática dos polisacáridos para obter azucres fermentables. Para isto, fíxose unha primeira proba de hidrólise enzimática co sólido resultante do tratamento de autohidrólise a 140 °C (Anexo B). Este sólido, como cabía esperar, estaba formado principalmente por glicano e lignina (31,26 e 30,59 g/100 g sólido, respectivamente), con recuperacións dun 93 e dun ≈100% do glicano e lignina presentes no WIS. En 24 h de sacarificación con endopoligalacturonasas, celulasas e β-glicosidasas, conseguiu solubilizarse o 79,83% do glicano, acadando concentracións de 22,41 g/L de glicosa. Para afondar máis neste tema, caracterizáronse os sólidos obtidos no traballo do Anexo D. Neste caso, no tratamento con DES recuperáronse arredor dun 86,21% do glicano e dun 86,75% da lignina, mentres que no sólido de autohidrólise se recuperaron o 98,21% do glicano e un 99,53% da lignina. En vista da composición dos dous sólidos, decidiuse avaliar a valorización do de autohidrólise mediante a produción de etanol, polo seu maior contido en glicano (39,69 vs 32,19%). Os resultados deste traballo preséntanse no Anexo E. Para a hidrólise enzimática empregáronse dous preparados comerciais: Cellic® CTec2 (116 FPU/mL) e Viscozyme L (4348,7 U/mL, sendo 1 U a cantidade de enzima capaz de catalizar a formación de 1 µmol de ácido galacturónico por minuto a 37 °C e pH=5 a partir de ácido poligalacturónico 0,5%). Para a optimización propúxose un deseño experimental Box-Behnken de tres variables a tres niveis, no que se seleccionaron como variables independentes: a relación líquido-sólido (LSR, 10-25 g/g), a relación Cellic CTec2-substrato (CSR, 5-30 FPU/g) e a relación Viscozyme-substrato (VSR, 10-40 U/g). A partir dos resultados destes experimentos, seleccionáronse a LSR de 10 g/g, a CSR de 17,5 FPU/g e a VSR de 40 U/g. Nestas condicións acadouse unha alta conversión de glicano a glicosa 24 h (85,66%), cunha concentración de 35,15 g/L de glicosa. Aínda que o uso de Viscozyme non afectou o rendemento de produción de glicosa, si que se observou que esta enzima favorece notablemente a solubilización do sólido, xa que este presenta unha alta capacidade de retención de auga, típico de materiais ricos en pectina. Co obxectivo de propoñer un esquema de biorrefinería que integre as correntes do proceso, para a produción de etanol o medio de cultivo formulouse co sólido de autohidrólise, xunto co zume obtido do centrifugado inicial do melón (cun alto contido en glicosa, frutosa e proteínas). Ademais, avaliouse a necesidade de nutrientes externos. Os escenarios propostos foron os seguintes:: i) fermentación do zume de melón (virxe e concentrado); ii) sacarificación e fermentación simultáneas (SSF) do sólido formulando o medio con zume de melón (virxe e concentrado), avaliando tamén a alimentación por cargas; iii) fermentación secuencial do zume concentrado e SSF do sólido; e iv) SSF do sólido con zume de melón virxe e fermentación do zume restante por separado (virxe e concentrado). Os resultados demostraron que a aportación de nutrientes non é necesaria, acadando unha produción máxima de 17,48 g de etanol/100 g MP por SSF e fermentación separada do zume virxe, e unha concentración de etanol máxima de 56,24 g/L por SSF con zume concentrado. En xeral, os traballos contidos nesta Tese de Doutoramento demostraron o potencial da valorización integral das pelas de melón, obtendo produtos de valor engadido con interesantes aplicacións nas industrias alimentaria, farmacéutica e cosmética.