Biodiversity from a global health approach through molecular biology and massive sequencing strategiesParticular cases of Perkinsus olseni and SARS CoV2

Resumo

El ecosistema marino alberga una gran diversidad de organismos procariotas, eucariotas y virus que todavía hoy se desconocen en su totalidad. A nivel ecológico, cada organismo cumple con una serie de funciones fundamentales que resultan en la interacción de unos organismos con otros, obteniendo así el equilibrio de un ecosistema. Sin embargo, diversos factores como cambios en los parámetros ambientales (temperatura, salinidad, etc.) la introducción de especies en nuevas zonas geográficas, en su mayoría propiciados por la actividad humana, y el cambio climático, pueden favorecer la proliferación de organismos patógenos, provocando en casos muy severos mortalidades masivas de especies. Esto puede producir a nivel ecológico la alteración de la biodiversidad y el equilibrio del ecosistema, y a nivel económico, grandes pérdidas en el sector acuícola. Esto sumado a la falta de conocimiento sobre la biología de determinados patógenos hace que sea muy compleja la erradicación total de las enfermedades, y que la lucha contra las patologías se base en la aplicación de medidas preventivas de monitoreo, con la finalidad de detectar patógenos y predecir la posible aparición de enfermedades (FAO, 2020). La presente tesis doctoral aborda el estudio de la biodiversidad de un ecosistema marino costero localizado en la Ría de Vigo mediante metodologías basadas en biología molecular y en la secuenciación masiva de última generación. Esta zona es conocida por su elevada productividad en el sector acuícola y por la gran actividad industrial de las principales ciudades que la rodean. Por ello, también se estudia la diversidad de bacterias que se encuentran en las aguas residuales que se vierten al ecosistema marino después de la depuración. De esta forma se relaciona la salud de las personas con la salud de los animales y el medio ambiente bajo el concepto amplio de “salud global”. Además de describir la biodiversidad de microorganismos del ecosistema marino costero y de las aguas residuales que se vierten en él, haciendo especial hincapié en potenciales patógenos, hemos profundizado en la detección de dos patógenos: Perkinsus olseni (patógeno en acuicultura de bivalvos) y SARS-CoV-2; virus causante de la pandemia Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). La ausencia de un sistema de monitoreo adecuado puede ser un obstáculo para conocer la presencia y distribución de patógenos en el ecosistema marino y los posibles efectos de las actividades humanas en el sector acuícola y la salud global. En los últimos años, numerosos estudios se han centrado en desarrollar y emplear herramientas de biología molecular para la descripción de la diversidad de un ecosistema, la detección de posibles patógenos y especies invasoras de interés, así como la interacción entre organismos (Amin et al., 2012; Hernández-Ruiz et al., 2018, Brisson et al., 2019; Durham, 2021; Joglar et al., 2021) en una gran variedad de ambientes marinos (Sogin et al., 2006; de Vargas et al., 2015). En esta tesis, además de emplear herramientas moleculares basadas en la PCR, nos centramos en la aplicación de la técnica del DNA metabarcoding. Este método se basa en la secuenciación masiva de amplicones de un gen de interés extraídos de una muestra ambiental o de un organismo concreto, permitiendo la identificación taxonómica de miles de organismos simultáneamente. Esta metodología permite la detección de especies desconocidas difíciles de detectar y caracterizar mediante métodos tradicionales, debido a la imposibilidad de ser cultivados en el laboratorio. En los capítulos 2 y 3 se describe la diversidad de organismos eucariotas y procariotas de un ecosistema marino costero durante el período 2016-2018. Aplicando la técnica del DNA metabarcoding estudiamos en este ecosistema marino tanto el sedimento como diferentes fracciones de la columna de agua: mesoplankton (>200 µm), microplankton (200-65 µm) y nano-picoplankton (65-0.22 µm). Se observaron diferencias en cuanto a la presencia de organismos eucariotas en sedimento y la columna de agua. El grupo de los protistas fue el más diverso, siendo el clado TSAR (Telonemida, Stramenopiles, Alveolata y Rhizaria) el principal grupo de este reino. En el ecosistema marino estudiado se detectaron patógenos potenciales, especies invasoras, así como agentes causantes de proliferaciones fitoplanctónicas nocivas, todos ellos pertenecientes al grupo de eucariotas. La mayoría de los patógenos identificados se caracterizaron por tener un impacto severo en el sector acuícola, o afectar a especies relevantes del ecosistema marino, como son las diatomeas. Además, también se detectaron patógenos de gran importancia médica y veterinaria, entre los que se incluyen, Toxoplasma sp., Cryptosporidium sp. y Babesia sp. Entre los patógenos de interés en acuicultura destacaron aquellos causantes de enfermedades en peces, como Philasterides sp. y Pseudocohnilembus sp., que provocan la scutocociliatosis o Rhogostoma sp., agente causante de la enfermedad nodular de la branquia. También se detectaron patógenos de moluscos bivalvos, como Perkinsus olseni, principal agente de la Perkinsosis y enzoótico de la zona de estudio, y patógenos que, a pesar de no tener efectos en el sector acuícola, los tienen en el funcionamiento del ecosistema. Es el caso de las gregarinas, detectadas sobre todo en el sedimento y microplankton y entre las que se incluyen Selenidium sp. y Pseudopirsonia sp., patógenos de poliquetos y diatomeas respectivamente. Se observaron grandes diferencias en los eucariotas y procariotas presentes en cada compartimento ambiental estudiado (sedimento, mesoplankton, microplankton y nanoplankton) con una gran cantidad de organismos exclusivos de cada compartimento, especialmente en el sedimento. Los resultados obtenidos confirman la importancia del estudio del sedimento, considerado uno de los ecosistemas más diversos del ecosistema marino. Las redes de co-ocurrencia mostraron posibles asociaciones entre organismos en las aguas someras siendo principalmente positivas (co-ocurrencias), como la cooperación o mutualismo y principalmente entre organismos procariotas, seguido de la correlación entre organismos procariotas-eucariotas y en menor medida entre eucariotas. El orden Flavobacteriales se considera como uno de los más involucrados en las correlaciones, así como las Gammaproteobacterias y Cianobacterias. Las diatomeas bentónicas (Amphora sp., Navicula sp.) tienen un papel fundamental en la producción primaria, ya que transforman el CO2 en materia orgánica, lo que promueve el crecimiento y la actividad remineralizadora de bacterias heterótrofas. Esto se refleja en las correlaciones entre eucariotas y procariotas, siendo la mayoría positivas entre bacterias heterótrofas del orden Flavobacteriales y diatomeas. Las correlaciones negativas (co-exclusiones) fueron menos abundantes destacando las encontradas entre bacterias y artrópodos, sugiriendo interacciones patogénicas y entre bacterias, debido probablemente a una competencia por recursos comunes. Se destaca por tanto la importancia de estudiar la diversidad en zonas someras, ya que, en comparación con estudios previos realizados en la Ría de Vigo en zonas más profundas, encontramos una mayor diversidad de organismos en la columna de agua. Esto puede deberse al movimiento de organismos entre el sedimento y la columna de agua, favorecido por las interacciones positivas que se detectaron. La liberación de residuos de origen antropogénico al medio marino, la introducción de especies foráneas en aguas de lastre, así como cambios ambientales producidos por el cambio climático, pueden ser factores que modifiquen el ecosistema marino. Como consecuencia de ello, la proliferación de organismos patógenos y de especies invasoras pueden llegar a favorecer el incremento de interacciones negativas de competencia por recursos y disminuir la resistencia de organismos frente a patógenos. Como consecuencia de esto, puede provocarse la aparición de enfermedades emergentes que puedan afectar así el equilibrio del ecosistema marino en la Ría de Vigo. Una de las principales preocupaciones en el ámbito de la salud global, es la contaminación de los océanos propiciada por la actividad humana. Esta contaminación puede ser química, mediante la liberación de residuos industriales (fertilizantes, plásticos, combustibles), sin embargo, el vertido de aguas residuales al mar es uno de los principales causantes de la contaminación biológica causando un gran impacto ambiental en el caso de un tratamiento ineficiente de las mismas. La Ría de Vigo está rodeada de ocho municipios que concentran aproximadamente 400.000 habitantes (Guerra et al., 2002) con varias estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR) que liberan los efluentes, una vez depurados, directamente al mar. La demanda global de agua ha ido aumentando constantemente, especialmente en zonas con déficit de recursos hídricos, donde el agua de vertido de las EDAR se utiliza como agua de riego en agricultura, fuentes de agua potable o con fines recreativos. Las aguas residuales contienen contaminantes entre los que se incluyen metales pesados o nutrientes, que pueden producir la eutrofización de ecosistemas acuáticos. También se liberan bacterias resistentes a antibióticos y patógenos (virus, bacterias y eucariotas) (Rizzo et al., 2013; Templar et al, 2016). La desinfección ineficiente de las aguas residuales puede liberar al ambiente una elevada carga de patógenos que afectan a humanos y animales, siendo uno de los principales canales de transmisión de enfermedades, y resultando en un riesgo potencial de salud global que afecta tanto a la salud animal, humana y a la del medio ambiente. El término de “salud global” reconoce que la salud animal, vegetal y humana está interconectada con el ecosistema en donde habitan. En el capítulo 4 se empleó la técnica del DNA metabarcoding en aguas residuales procedentes de la depuradora de Baiona antes (M1) y después del proceso de desinfección (M3), y en mejillones localizados cerca de la zona del vertido de la depuradora en la Ría de Vigo que actuarían como bioindicadores. La finalidad de este capítulo consiste en describir la variación en la presencia de organismos procariotas en cada tipo de muestra y evaluar la efectividad del tratamiento de las aguas residuales. Para ello se estudian los procariotas patógenos o procedentes del microbioma intestinal del ser humano o de animales domésticos en aguas después de la desinfección, y si estos los podría llegar a incorporar el mejillón, debido a su elevada capacidad filtradora. Se recogieron un total de 29 muestras en la estación depuradora de Baiona en dos períodos estacionales: primavera (mayo-junio 2020) e invierno (diciembre 2020-enero 2021) y se secuenció mediante Illumina la región V3-V4 del gen ARNr 16S. Los procariotas presentes en las muestras de agua de entrada en la depuradora (M1), las de salida después de la desinfección (M3) y las de mejillón variaron considerablemente. Además, también se observaron variaciones estacionales en cuanto a la presencia de bacterias en varios muestreos de un mismo compartimento. Las bacterias procedentes del microbioma intestinal humano, incluidos patógenos potenciales (Arcobacter sp., Clostridium sp.), fueron representativas de las aguas residuales de entrada en la depuradora (M1). Estos organismos se eliminaron en gran parte después del tratamiento de desinfección de la EDAR (M3) y en los mejillones utilizados como bioindicadores del medio marino, situados en la zona de vertido del efluente. Por ello, se puede confirmar la eficiencia de la depuración, aunque en algunos casos se detecta el ADN de posibles patógenos en M3, siempre con menor abundancia que M1. Una vez que confirmamos que la aplicación de la metodología del DNA metabarcoding es una herramienta útil para el monitoreo de organismos patógenos de interés en el ámbito de la salud global, en los capítulos 5 y 6 de esta tesis nos centramos en la detección específica dos patógenos de elevado interés en el ámbito de la salud animal y la salud humana: Perkinsus olseni y SARS-CoV-2 respectivamente. El patógeno Perkinsus olseni, afecta a una gran variedad de moluscos bivalvos en todo el mundo y genera grandes pérdidas económicas en el sector acuícola. Debido a su gran impacto, se ha incluido en el listado de organismos de declaración obligatoria por la Organización Mundial de Salud Animal (OIE, 2021). P. olseni es un patógeno enzoótico en Galicia, por lo que fue considerado como caso de estudio en la tesis. En el capítulo 5, se describe el diseño de un método de diagnóstico rápido sensible y específico para el diagnóstico de P. olseni en almeja basado en la PCR cuantitativa (qPCR). Además, se compara el nuevo método frente a los métodos tradicionales recomendados por la OIE: histopatología y el método de cultivo en tioglicolato de Ray (RFTM). Los ensayos mediante qPCR se realizaron tanto en branquia como en hemolinfa de almejas comerciales, con la finalidad de valorar la posibilidad de un diagnóstico del parásito no invasivo. Con los cebadores diseñados, se evalúa la sensibilidad, especificidad y eficiencia de los mismos, así como la reproducibilidad de la técnica mediante intercomparativos. La mayor prevalencia de P. olseni se detectó mediante qPCR, y la correlación lineal más fuerte se obtuvo entre los niveles de infección por la técnica del RFTM y los valores de Ct obtenidos mediante la qPCR en branquia. A pesar de que mediante la qPCR se detectaron mejores resultados en branquia que en hemolinfa, especialmente en infecciones leves o muy leves, se observó una correlación lineal entre los valores de Ct de branquia y hemolinfa. La qPCR desarrollada en este capítulo de la tesis se caracteriza por su elevada sensibilidad, especificidad y reproducibilidad para la detección y cuantificación de P. olseni. El diseño de la qPCR aportó una mejora en los métodos diagnósticos del parásito con la finalidad de facilitar su detección y así permitir un diagnóstico temprano y eficaz de la enfermedad. En el capítulo 5 también se analizó la distribución temporal y espacial de los posibles estadíos de vida de P. olseni en un área enzoótica del parásito, desde el 2016 al 2018 mediante secuenciación masiva, la PCR cuantitativa específica de Perkinsus previamente descrita en este mismo capítulo e histopatología. A partir de los resultados obtenidos en las secuenciaciones masivas de eucariotas se realizaron búsquedas específicas de P. olseni en todos los muestreos de agua (meso, micro y nanoplankton) y de sedimento. Además, se analizó la presencia de P. olseni en bivalvos de interés comercial recolectados en los mismos días de muestreo que las muestras de agua y sedimento. En paralelo, se empleó el método diagnóstico desarrollado de qPCR sobre las mismas muestras ambientales y de moluscos, y a partir de ADN y ADN complementario (ADNc), con el objetivo de detectar el estado replicativo del parásito. No se detectó P. olseni en el ambiente mediante qPCR, pero sí mediante secuenciación masiva en todos los muestreos de sedimento y de cada fracción de la columna de agua, llegando a mostrar un patrón estacional de prevalencias. Como era de esperar, el parásito se detectó mediante secuenciación en almejas, sin embargo, también se detectó en algunos casos en mejillón (Mytilus galloprovincialis) y berberecho (Cerastoderma edule). P. olseni no se había encontrado previamente en berberecho, pero su presencia se confirmó además mediante histopatología y qPCR, aunque en intensidades muy bajas. Por ello, se confirma a C. edule como nuevo hospedador de P. olseni. Con este capítulo se pudo concluir que la secuenciación masiva del gen ARNr 18S y el método de PCR cuantitativa combinado con métodos clásicos como la histopatología permitieron determinar la prevalencia, intensidad y el estado replicativo del parásito en varias especies de bivalvos y en el ambiente. Este enfoque podría emplearse para mejorar el manejo de la enfermedad e incluso en la prevención de la misma. En los últimos años, el principal problema de salud pública a nivel mundial ha sido originado por el virus SARS-CoV-2. Este patógeno es un coronavirus causante de un síndrome respiratorio agudo severo y cuya expansión mundial provocó la actual pandemia de COVID-19, oficialmente declarada en enero del 2020 por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Además de las sintomatologías respiratorias, el virus también puede provocar síntomas gastrointestinales y liberarse a través de las heces y orina (Cheung et al., 2020, Randazzo et al., 2020). Se ha comprobado que la detección de ARN de SARS- CoV-2 en aguas residuales mediante PCR cuantitativa puede ser un método eficaz para una detección temprana de la enfermedad y así ayudar a las autoridades a establecer estrategias de coordinación y control de la pandemia (Randazzo et al., 2020; La Rosa et al., 2021). Esta estrategia podría aplicarse a todo tipo de enfermedades infecciosas del mundo vegetal y animal (sanidad humana y animal). En el capítulo 6 se describe la detección del material genético de SARS-CoV-2 en 15 EDAR de Galicia durante un año (mayo 2020-mayo 2021) mediante RT-qPCR. Se analizaron varios tipos de muestras, entre los que se incluyen aguas residuales de diferentes puntos de tratamiento de las EDAR: agua de entrada en la depuradora (M1), agua antes de la desinfección (M2), agua después de la desinfección (M3) y fango espesado (M5). En el ambiente marino, se recogió agua de mar en el punto de vertido (M4) y biondicadores: sedimento (BIOIND-S), mejillón salvaje (BIOIND) y de acuicultura (BIOIND-A). Se prestó especial atención al mejillón como bioindicador, ya que debido a su elevada capacidad filtradora de agua podría incrementar la posibilidad de concentrar RNA viral, permitiendo detectar si el material genético del virus llegaba al medio marino y sugerir la necesidad de realizar pruebas de viabilidad. La detección de SARS-CoV-2 se llevó a cabo a partir de ARN aislado de cada tipo de muestras mediante RT-qPCR. En las muestras de agua se realizó una previa concentración de virus, con la finalidad de obtener una detección más eficiente del mismo. Se emplearon tres parejas de primers diferentes para la detección del virus mediante RT-qPCR: N1, N2 y E. Los dos primeros amplifican el gen N de la nucleocápside, mientras que el tercero amplifica el gen E de la envuelta. Con los resultados obtenidos, se pudo confirmar que la detección de material genético de SARS-CoV-2 en el agua de entrada (M1) es un método sensible para detectar nuevos brotes de COVID-19 y mejorar el estudio de la evolución de la pandemia en la comunidad. Con el monitoreo del agua de entrada, se pudo anticipar la detección de nuevos brotes con una semana de antelación a los confirmados por las autoridades sanitarias en la 3ª y 4ª ola de COVID-19 producidas en Galicia y España en noviembre 2020 y enero 2021 respectivamente. En comparación con otras investigaciones realizadas sobre la presencia de SARS-CoV-2 en aguas residuales, se estudió la detección del virus en el medio marino y la capacidad de las EDAR para eliminar el virus. Los resultados confirmaron la capacidad de los reactores biológicos y el sistema de desinfección en EDAR para su eliminación. El estudio de la presencia de material genético del virus en el medio marino en el punto de vertido de las EDAR reveló un impacto potencial menor del SARS-CoV-2 en agua de mar y especies de moluscos, pudiendo asociarse la detección del virus en agua de mar y especies de moluscos muestreados al vertido incontrolado de aguas residuales. Con los resultados obtenidos en la tesis se puede concluir que los métodos de secuenciación masiva basados en el DNA metabarcoding permiten obtener una visión global de la variación en los organismos presentes en un determinado compartimento ambiental y las posibles interacciones entre las distintas especies que predominan en el ambiente estudiado. En este caso se pudo confirmar la importancia del estudio del sedimento, uno de los “compartimentos” marinos más diversos y con un mayor número de especies eucariotas todavía no caracterizadas ni recogidas en las bases de datos de referencia. Además, se observó un mayor número de coocurrencias relacionadas con la cooperación e interacciones mutualistas. La detección de patógenos en el ecosistema marino se enfocó bajo el concepto de salud global, siendo el estudio de aguas residuales un claro ejemplo de interconexión entre la salud humana, animal y ambiental. Por ello, uno de los principales intereses del estudio de las EDAR fue el rastreo de organismos patógenos desde el agua de entrada de la depuradora hasta la salida de la misma y su vertido al ecosistema marino. Una vez estudiada la diversidad general de organismos patógenos en el ambiente, tanto en el medio marino como en las aguas residuales, realizamos un estudio específico de patógenos de interés en la salud animal (P. olseni) y salud humana (SARS-CoV-2) mediante la aplicación de técnicas moleculares complementarias. De esta forma se pudo conocer la distribución en el ambiente de P. olseni y la identificación de nuevos hospedadores (C. edule) aplicando métodos de secuenciación masiva, qPCR e histopatología, y la detección temprana del virus SARS-CoV-2 ante nuevos brotes de COVID-19 mediante qPCR.