Estudio ecofisiológico de poblaciones de elymus spp., en respuesta al estrés hídrico y salino

Resumo

Elymus elongatus (Host) Runemark subsp. ponticus (Podp.) Melderis [sinónimo de Thinopyrum ponticum (Podp.) Barkworth y D.R. Dewey] es una gramínea perenne C3, nativa de los hábitats secos o salinos del sudeste europeo, conocida con el nombre común de “Agropiro alargado” o en lengua inglesa “tall wheatgrass”. Agropiro alargado muestra una gran adaptación a suelos marginales con problemas de salinidad y/o alcalinidad en climas templado húmedos a semiáridos. Por ello, el principal uso es como forrajera en ambientes con limitaciones climato- edáficas, siendo la pastura más importante en los sistemas de cría de ganado vacuno que se realiza sobre suelos hidro-halomórficos de la Cuenca del Salado en Argentina. Además, agropiro alargado posee un gran potencial como fitorremediadora, biocombustible y, dado su parentesco con el trigo, como donadora de genes de tolerancia al estrés biótico y abiótico. Los sistemas productivos agro-ganaderos se ven afectados por el cambio climático. El cambio climático trae aparejado déficit hídrico con mayor frecuencia e intensidad, así como un incremento en la salinización de tierras y la desertificación. El déficit hídrico, provocado tanto por sequía como por salinidad, ocasiona diferentes respuestas en la planta según la especie, el genotipo y el estado fenológico, las cuales pueden ser modificadas dependiendo de la intensidad y duración del estrés. En gramíneas, la primera fase del estrés por sequía o salinidad ocasiona estrés osmótico en la planta, la cual responde con el cierre de estomas, limitando la transpiración, el intercambio de gases y la fotosíntesis, causando una menor elongación y división celular que determina la reducción de la tasa de elongación foliar (TEF). En caso de que el estrés hídrico y/o salino persista, se registra una reducción más importante en el follaje a través de cambios en la anatomía celular, resultando en hojas más pequeñas y gruesas (menor área foliar específica, AFE), acompañadas por una reducción en la aparición de hojas (TAH) y macollos. Estas respuestas están asociadas a cambios en la relación hídrica de las células, y no a la toxicidad de las sales. Las plantas activan mecanismos para recuperar el equilibrio osmótico con solutos inorgánicos y orgánicos, así como para controlar el estrés oxidativo, lo que define su adaptación a las condiciones de sequía y salinidad. En algunas especies, la acumulación de Na+ y Cl- secuestrados en la vacuola celular puede contribuir a restablecer el balance osmótico celular, junto con una acumulación de K+ y de solutos orgánicos en el citoplasma, como la prolina, que ayudan a equilibrar la presión osmótica de los iones en la vacuola y a incrementar el potencial osmótico celular. En una segunda fase, cuando las altas concentraciones de Na+ y Cl- superan la capacidad de la célula para compartimentalizar estos iones en la vacuola, la salinidad puede producir desequilibrio nutricional y toxicidad en la planta. Ambos tipos de estrés, hídrico y salino, pueden inducir la senescencia prematura de las hojas adultas, incrementando la tasa de senescencia foliar (TSF), si bien este proceso se da de forma anticipada en caso de estrés salino, por ser en las hojas adultas donde la transpiración ha acumulado Na+ y Cl- durante más tiempo. Finalmente, si el estrés hídrico o salino se prolonga durante meses, puede verse afectado el estado reproductivo e incluso la supervivencia de la planta. La respuesta de la planta se traduce en cambios en el crecimiento, desarrollo, morfología, fisiología y adaptaciones celulares; siendo clave los mecanismos de ajuste osmótico para superar el estrés, con la prolina como principal soluto gracias a sus funciones de osmoprotección y de osmoregulación. El desequilibrio nutricional debido a las altas concentraciones de Na+ y Cl-, se observa especialmente en la absorción y/o asimilación de potasio y nitrógeno, siendo también importantes las relaciones entre nutrientes, como es el caso de la relación Na+/K+. En forrajeras perennes, la identificación de fenotipos tolerantes al estrés hídrico o salino en función de sus características agronómicas y fisiológicas sigue siendo una tarea compleja y costosa, que necesita ser evaluada a lo largo de varios años. Por ello, se siguen buscando caracteres indicadores más simples y con alta heredabilidad para valorar la tolerancia al estrés. En este contexto, la composición de los isótopos estables de carbono 12C 13C (δ 13C) y de nitrógeno 14N, 15N (δ 15N) aparecen como una posibilidad interesante, ya utilizada en cereales. El isótopo δ 13C proporciona información sobre la eficiencia de la transpiración a largo plazo y se ha correlacionado con el rendimiento y la tolerancia al estrés hídrico y/o salino en gramíneas C3. Además, en diferentes estudios sobre cereales, δ 13C ha demostrado ser un caracter altamente hereditario. Así mismo, la concentración de N puede verse reducida por el déficit hídrico del suelo, generado tanto por situaciones de sequía como de salinidad, debido a limitaciones en la absorción y la asimilación. El metabolismo del nitrógeno está directamente asociado con el isótopo de δ15N, y ha sido utilizado para diferenciar genotipos tolerantes y susceptibles a la sequía y/o la salinidad en gramíneas anuales. El cambio climático, así como el aumento de la sequía, asociado o no al mismo, y la salinización de las tierras, imponen importantes limitaciones a los sistemas productivos agropecuarios. Por ello, los programas de mejoramiento de forrajes buscan urgentemente incrementar la producción de biomasa aérea, así como la tolerancia a la sequía y la salinidad. Las especies silvestres son recursos extremadamente ricos en variabilidad genética, que no están disponibles en el acervo genético cultivado, y que podrían ayudar a mejorar la productividad de los cultivos y la sostenibilidad ambiental, siendo importante estudiar el comportamiento de la especie y la variación intraespecífica existente para poder seleccionar de forma efectiva el mejor germoplasma en función de las limitaciones ambientales en las que será cultivado. En consecuencia, en esta Tesis de Doctorado se ha propuesto la siguiente hipótesis de trabajo: “En poblaciones de agropiro alargado que provienen de orígenes ambientales que contrastan en sus características climato-edáficas, existen diferentes comportamientos en los caracteres morfológicos, fisiológicos, bioquímicos e isotópicos que determinan distintas estrategias de crecimiento y/o mecanismos fisiológicos para tolerar el estrés hídrico y salino”. Para la validación de esta hipótesis se planteó el siguiente objetivo de estudio: Comprender el comportamiento de distintas poblaciones de agropiro alargado en respuesta al estrés hídrico, salino y combinado, para detectar características morfológicas, agronómicas, fisiológicas, bioquímicas y/o isotópicas que permitan seleccionar el germoplasma con mayor tolerancia al estrés hídrico y/o salino. En consecuencia, esta Tesis Doctoral puede aportar nuevos conocimientos sobre las estrategias de crecimiento y los mecanismos fisiológicos que determinan la tolerancia al estrés hídrico, salino y combinado en agropiro alargado, así como sobre las variables más efectivas para diferenciar el germoplasma más adaptado al estrés. Estos conocimientos podrían ayudar a seleccionar el germoplasma más adecuado para expandir la producción de cultivos según su uso en diferentes ambientes ante el cambio climático imperante. Para dar respuesta a la hipótesis planteada en esta Tesis Doctoral se desarrollaron cuatro ensayos, uno evaluando la respuesta al estrés hídrico durante 35 días (SH_35d), otros dos frente al estrés salino con diferente duración, 40 y 85 días (ES_40d y ES_85d); y uno más, combinando el estrés hídrico y salino durante 90 días (EHxES_90d). En todos los ensayos fue utilizado un diseño en bloques completos al azar (BCA) con un arreglo factorial en los tratamientos. Los factores corresponden a las poblaciones de agropiro naturalizadas (Pobla), y a los tratamientos de estrés hídrico (EH) y/o de estrés salino (ES). En todos los casos se realizó un análisis de la varianza y una comparación de medias con la prueba de DMS, considerando una probabilidad de 0,05% y utilizando el paquete estadístico SAS. En la elección del germoplasma se tuvieron en cuenta los orígenes ambientales más extremos y la disponibilidad de semillas en el banco de germoplasma BAL-INTA, siendo seleccionadas para esta Tesis de Doctorado cuatro poblaciones naturalizadas denominadas Pobla: P3, P4, P5 y P9. Las poblaciones P3 y P9 provienen de ambientes con clima templado húmedo que difieren en el tipo de suelo, ya que P3 viene de un suelo no salino ni alcalino, mientras que P9 proviene de un suelo salino-alcalino. Las otras dos poblaciones, P4 y P5, provienen de ambientes con clima semiárido y diferente suelo, salino-alcalino en el caso de P4 y suelo no salino-ni alcalino para P5. Las plantas de agropiro alargado evaluadas fueron obtenidas a partir de semillas germinadas y trasplantadas a macetas en un invernadero del Campus Lagoas-Marcosende de la Universidade de Vigo (España), donde se desarrollaron los experimentos. En el primer experimento de estrés hídrico (EH_35d) fueron evaluadas características morfo-fisiológicas en las cuatro poblaciones (P3, P4, P5, P9) bajo tres condiciones de estrés hídrico: leve, moderado y severo (100% -50% -30% de la capacidad de campo de las macetas, respectivamente), en invernadero y con plantas en estado vegetativo (macollaje) durante 35 días, empleándose 3 repeticiones. Las variables registradas fueron la producción de materia seca (MS), los caracteres morfogenéticos y estructurales del canopeo, como largo, ancho y área de las hojas, área foliar especifica (AFE), peso (Pmac) y número de macollos (densidad, en 4 tiempos de medida), evapotranspiración acumulada (ETA), eficiencia en el uso del agua (EUA), contenido hídrico relativo foliar (CHR), y concentración de prolina libre y de proteínas foliares. Los resultados mostraron interacción entre las poblaciones y las condiciones hídricas solo en la producción de materia seca y el número de macollos. Los cambios más relevantes en los parámetros morfofisiológicos comparando la intensidad del estrés hídrico fueron la reducción de la producción de materia seca, el menor tamaño de hojas y macollos, junto con un menor número de macollos, conjuntamente con un mayor contenido de prolina y proteína, una mayor eficiencia en el uso del agua y una ligera disminución en el contenido de agua foliar. Las poblaciones difirieron en las estrategias de crecimiento (ancho y área foliar, y Pmac) y mecanismos morfofisiológicos (CHR, EUA, prolina y proteína) para sobrevivir al estrés hídrico, lo que podría estar relacionado con su hábitat de origen. La población P3, destacó en situaciones de estrés leve a moderado, presentando mayor biomasa, con hojas y macollos de mayor tamaño, con un mayor CHR y una EUA intermedia, así como altos valores de proteínas foliares. Mientras, P5 presentó una alta densidad de macollos y la EUA más elevada, con valores intermedios de proteína foliar, produciendo más biomasa en estrés severo y moderado. El estudio muestra que la estabilidad en la producción de materia seca en los niveles de estrés hídrico, podría estar relacionada con mecanismos que logren altos valores de proteína foliar y EUA, además de mantener una alta densidad de macollos como estrategia de crecimiento. El estrés salino fue analizado en el segundo y tercer experimento con diferente duración, 40 días otoñales y 85 días primaverales (ES_40d y ES_85d, respectivamente). En ambos ensayos, las poblaciones (P3, P4, P5, P9) fueron evaluadas frente a cinco niveles de salinidad, regando con soluciones salinas preparadas con diluciones de cloruro sódico en agua a concentraciones de 0; 0,1; 0,2; 0,3 y 0,4 M de NaCl. En ES_40d fueron registradas variables morfogenéticas, estructurales, productivas y fisiológicas en plantas en estado vegetativo, utilizando siete repeticiones; mientras que, en el experimento de mayor duración, ES_85d, fueron registradas variables estructurales, productivas, fisiológicas, bioquímicas e isotópicas en las plantas en estado vegetativo-reproductivo con cinco repeticiones. En general, se observó que el incremento en salinidad redujo la tasa fotosintética neta, el crecimiento (menores valores de TEF, TAH, tamaño foliar, densidad y peso de macollos) y el desarrollo (reducción en el %floración), aumentando la senescencia (mayores valores de TSF, necromasa), conjuntamente con el incremento en la acumulación de iones Na+, Cl- y el aumento exponencial en el contenido de prolina. La prolina, el Na+ y el Cl- parecían funcionar sistemáticamente como agentes osmóticos, permitiendo el mantenimiento del agua en los tejidos para continuar la actividad fotosintética, con incrementos en δ13C y reducciones en δ15N. Las hojas aumentaron la concentración de N (ES_85d) y proteína (ES_40d), discriminando más δ15N a mayor salinidad, lo cual indicaría que el metabolismo del nitrógeno no es una limitante para el crecimiento. Las poblaciones mostraron un comportamiento diferente en las variables registradas. La población P5 mostró la mayor biomasa en el experimento de 85 días, presentando la mayor longitud foliar y densidad de macollos, conjuntamente con la mayor eficiencia en el uso del agua y valores de isótopo δ13C; y la menor concentración de Cl- y tasa de evapotranspiración. Sin embargo, P5 mostró la biomasa más baja en el experimento de 40 días, donde destacó la población P3, con el mayor ancho foliar y AFE. Estos comportamientos intraespecíficos sugieren que la duración del estrés es un aspecto importante a considerar al seleccionar el germoplasma para su tolerancia a la salinidad. En el cuarto experimento de estrés hídrico y salino combinado (EHxES_90d) fueron evaluadas las poblaciones (P3, P4, P5, P9) sometidas a tres condiciones de estrés hídrico: leve, moderado y severo (100% -50% -30% de la capacidad de campo de las macetas), y tres condiciones de estrés salino: ausente, moderado y severo (regando con soluciones acuosas de 0; 0,1; y 0,3 M NaCl). Para conocer la respuesta al estrés combinado entre las poblaciones se registraron caracteres estructurales, productivos, fisiológicos, bioquímicos e isotópicos en las plantas en estado vegetativo-reproductivo, con cinco repeticiones durante 90 días primavero-estivales. La mayoría de las variables mostraron interacción entre el estrés hídrico y salino, y ausencia de interacción con las poblaciones. La tasa fotosintética neta se redujo con el tiempo y el estrés hídrico y salino. A mayor estrés hídrico y salino disminuyeron la biomasa total y del tallo, las espigas y la altura de planta, así como la evapotranspiración, mientras que la senescencia de tejidos, el δ13C y la prolina aumentaron, con registros extremos entre el control y el máximo estrés combinado. Por otro lado, la concentración de N y K+ foliar aumentaron ante el estrés hídrico en cada condición salina, determinando una disminución de la relación Na+/K+ a mayor estrés. Las variables estructurales como longitud foliar y densidad de macollos, así como la eficiencia en el uso del agua, presentaron valores superiores al control en algunas combinaciones de estrés hídrico y/o salino leve o moderado. En cambio, la biomasa foliar, AFE y CHR aumentaron con estrés hídrico o salino, pero sin presentar interacción, mientras que solo se vieron afectados por el estrés salino la concentración foliar de Na+ y Cl-, que aumentaron, y el δ15N, que disminuyó a mayor salinidad. La estrategia para atenuar el estrés estaría relacionada con una menor evapotranspiración, cierre estomático (mayor δ13C), mayor senescencia foliar y menor desarrollo reproductivo (menor biomasa de tallos, %espigas y altura de la planta). Los mecanismos para mantener el potencial osmótico celular frente al estrés estarían relacionados con el incremento en el K foliar, especialmente ante estrés hídrico, y el aumento en la concentración de foliar de Na+ y de Cl-, particularmente frente a estrés salino, en tanto el incremento exponencial en prolina funcionaria en ambos estreses como osmoregulator y osmoprotector. Las poblaciones mostraron diferencias en las variables estructurales del canopeo y la biomasa producida (total, verde, tallo y muerta), destacándose P3 y P9 por un mayor desarrollo reproductivo a través de una mayor biomasa de tallo, %espigas y altura de la planta, pero con menor densidad de macollos; contrariamente a P4 y P5. Las poblaciones P4 y P5, que provienen de ambientes con mayor estrés, presentaron la menor evapotranspiración, aunque tendrían diferentes estrategias para controlar la transpiración, ya que P4 mostró la mayor proporción de biomasa muerta limitando la biomasa foliar fotosintéticamente activa, mientras que P5 presentó el mayor δ13C y la más alta eficiencia en el uso del agua, con la mayor biomasa foliar y producción de materia seca total ante estrés hídrico y salino. La población P3 mostró valores intermedios de biomasa total y, notoriamente P5 y P3 que provienen de ambientes no salinos, mostraron la menor relación Na+/K+, pudiendo relacionarse con un mejor funcionamiento metabólico. La biomasa producida se relacionó positivamente con la EUA y la δ13C. Además, δ13C presentó una alta heredabilidad en sentido amplio, seguida de las variables estructurales del canopeo, mientras que la relación Na+/K+ fue intermedia. Por ello, el uso combinado de los caracteres δ13C y la relación Na+/K+, podría ser útil para la selección de germoplasma por mayor producción y tolerancia al estrés hídrico y salino. Además, consideramos que las variables estructurales del canopeo podrían ayudar a elegir el fenotipo ideal según el sistema productivo donde será utilizado, siendo para pastoreo más conveniente una planta con mayor desarrollo vegetativo que priorice el macollaje (ej: P5), mientras que para la producción de henos o fardos sería mejor una planta con mayor desarrollo reproductivo y más erecta (ej: P3). Los caracteres registrados en cada experimento fueron analizados con regresión lineal múltiple para encontrar cuáles explicaban mejor la biomasa producida en cada situación de estrés hídrico y/o salino. Las comparaciones de los modelos de regresión obtenidos mostraron que la producción de biomasa aérea estaba determinada principalmente por caracteres relacionados con el estado hídrico de la planta (ETA, CHR, EUA), así como con los caracteres relacionados con la estructura del canopeo (tamaño y número de hojas y / o macollos), siendo más evidente en los ensayos de menor duración, tanto de estrés hídrico (EH_35d) como de estrés salino (ES_40d). Estos caracteres también fueron importantes para explicar la biomasa total frente a estrés hídrico y salino combinados (EHxES_90d). Sin embargo, en los ensayos de mayor duración, tanto de estrés salino (ES_85d) como de estrés combinado (EHxES_90d), la concentración de prolina fue el principal caracter para explicar la biomasa producida, seguida de la tasa fotosintética neta registrada al final de ambos ensayos. Sin embargo, al comparar el germoplasma en los diferentes ensayos fue el isotopo de δ13C la variable más importante para detectar diferencias intraespecíficas en los ensayos de mayor duración de estrés salino y combinado hídrico y salino, además de la relación Na+/K+ en este último. Estas variables no fueron medidas en los ensayos de menor duración (EH_35d y ES_40d), aunque fueron importantes las variables relacionadas con el estado hídrico de la planta, en especial la eficiencia del uso del agua, caracter con una fuerte relación con δ13C según indican la bibliografía y el presente estudio. Además, en todos los ensayos, las variables estructurales del canopeo fueron las más importantes registradas entre las variables morfométricas, las cuales permitieron diferenciar los fenotipos más tolerantes y productivos, siendo la densidad de macollos el caracter que mejor se relacionó con la estabilidad del rendimiento. A partir de los experimentos realizados en esta Tesis Doctoral, consideramos que la diversidad y tolerancia del germoplasma de agropiro alargado al estrés hídrico y salino puede ser utilizado para expandir la producción de cultivos en diferentes ambientes ante el cambio climático imperante.