Desarrollo de ensayos alternativos a los físico-químicos para la confirmación de biotoxinas marinas presentes en alimentos de origen marino

Resumo

El calentamiento actual de los océanos asociado al cambio climático, junto con el incremento del comercio internacional debido a una economía cada vez más globalizada, están afectando notablemente a los ecosistemas marinos. El efecto combinado de ambos procesos ha favorecido la dispersión, más allá de sus regiones endémicas, de organismos considerados vectores de contaminaciones naturales en alimentos de origen marino, suponiendo un riesgo de seguridad alimentaria. En este contexto, la expansión de la contaminación por ciguatera se ha convertido en un riesgo emergente para la salud de la población a nivel mundial, representando una causa relevante de intoxicación alimentaria no bacteriana derivada del consumo de productos marinos. Las áreas costeras de Europa no se han quedado al margen de esta expansión y, regiones tales como los archipiélagos macaronésicos (Canarias, Madeira, Cabo Verde, Salvajes y Azores) o incluso el mar mediterráneo, son considerados a día de hoy, como zonas críticas respecto a la incidencia de las microalgas responsables de esta contaminación (Gambierdiscus spp y Fukuyoa spp). En la actualidad se han descrito múltiples brotes de ciguatera en la Macaronesia por el consumo de pescado contaminado, donde las Islas Canarias destacan como el lugar donde se ha notificado el mayor número de casos autóctonos dentro del contexto europeo. Así, la ciguatera fue incluida en el Sistema de Enfermedades de Declaración Obligatoria (EDO) de las Islas Canarias y la caracterización del riesgo asociado se convirtió en una prioridad tanto para las autoridades sanitarias de las áreas afectadas como para la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA). Bajo este escenario surgió en el año 2016 el proyecto EUROCIGUA, en el cual se enmarca parte del trabajo realizado en la presente tesis. El trabajo desarrollado en este proyecto de Tesis Doctoral tiene como objetivos prioritarios la optimización de una metodología basada en el modelo celular N2a-MTT para la detección y semicuantificación de C-CTX1 en tejido de pescado, así como la determinación de su aplicabilidad en muestras contaminadas de forma natural. Dicha aplicabilidad consideró el estudio de la toxicidad total de diferentes especies de pescado y dinoflagelados procedentes de las áreas afectadas y evaluadas en el proyecto EuroCigua anteriormente citado. Igualmente, también se considero la aplicación del ensayo N2a-MTT en combinación con diferentes metodologías cromatográficas y LC-MS/MS, para contribuír a la caracterización e identificación de los diferentes análogos de C-CTXs involucrados en la contaminación, asi como a la purificación y aislamiento de C-CTX1, considerado el principal responsable de la toxicidad de los peces procedentes de las regiones de estudio. Para la implementación del modelo N2a-MTT se propuso la revisión y optimización de varios parámetros críticos que afectan directamente a la sensibilidad y reproducibilidad del ensayo de cara a la detección y semicuantificación de CTXs, como son: concentración óptima de Ouabaína y Veratridina (OV), tiempo de exposición o densidad de sembrado. Otro factor que se ha tenido en cuenta en la optimización del ensayo N2a-MTT ha sido la complejidad de la matriz biológica, pues incluye numerosos compuestos endógenos, los cuales, pueden inducir efectos tóxicos inespecíficos sobre las células N2a que interfieran sobre la especificidad y fiabilidad del ensayo. Las soluciones estudiadas incluyeron la aplicación de técnicas sencillas, tales como la dilución de la muestra o incluso la reducción de la dosis de tejido equivalente de pescado, aunque a costa de una pérdida evidente de sensibilidad. Debido a ello, también fueron estudiados procedimientos más complejos centrados en la preparación de la muestra y que tuvieron en cuenta la incorporación de diferentes etapas de cleanup o el cocinado inicial del tejido de pescado, como base para la eliminación de estas interferencias, sin comprometer la sensibilidad del propio ensayo N2a-MTT. Estudios adicionales de adición estándar, realizados sobre niveles no tóxicos de matriz, evidenciaron una disminución de la actividad tóxica de C-CTX1 en los extractos con un bajo nivel de purificación, reforzando la necesidad de aplicar un pretratamiento adecuado para las muestras evaluadas. El modelo N2a-MTT optimizado fue aplicado para evaluar la actividad tóxica de las fracciones resultantes tras un fraccionamiento cromatográfico HPLC-UV de diversos extractos obtenidos a partir de varias muestras de pescado procedentes de los Archipiélagos de las Islas Canarias y Madeira. Este enfoque combinado con métodos LC-MS permitió confirmar, identificar y caracterizar los principales compuestos con actividad tipo-CTXs involucrados en la contaminación de los peces procedentes de dichas regiones. Esta metodología también fue utilizada para el estudio del perfil tóxico de una cepa de Gambierdiscus australes, otorgando una primera visión general del tipo de compuestos relacionados con la toxicidad de dichos dinoflagelados en estas regiones. A pesar de las limitaciones en cuanto a la disponibilidad de estándares de MTXs y de biomasa vegetal, en este estudio se pudo asociar la principal contribución tóxica con una actividad tipo-MTXs. Asimismo, también se detectó actividad tipo-CTX moderada en varias regiones del perfil tóxico, aunque no se ha podido confirmar en ellas la presencia de C-CTX1 y de ninguno de sus análogos del Pacífico. Esto podría estar sugiriendo que las C-CTXs encontradas en los peces de estas regiones surgen como un resultado de procesos de biotransformación a lo largo de la cadena alimentaria. Finalmente, el ensayo N2a-MTT se aplicó en las diferentes etapas de un protocolo diseñado para la purificación y aislamiento de C-CTX1. La evaluación de los extractos obtenidos en cada una de las etapas de dicho procedimiento permitió detectar la presencia de compuestos ciguatóxicos y garantizar una recuperación adecuada, tanto de C-CTX1, como de los principales análogos presentes en los peces del NE Atlántico. El análisis posterior mediante N2a-MTT de las fracciones finales donde C-CTX1 fue aislada no mostró evidencias de interferencias causadas por la matriz, sugiriendo una purificación adecuada. La falta de estándares y materiales de referencia para C-CTX1 convierten a este tipo de procedimientos en herramientas indispensables, no solo para el avance en la validación y estandarización de metodologías analíticas en Europa, sino también para su caracterización toxicológica. Por tanto, de los resultados obtenidos en esta tesis doctoral se puede concluir que la revisión del método N2a-MTT ha permitido establecer, mediante el control de parámetros clave, las condiciones óptimas para la detección y semicuantificación de C-CTX1 en muestras de pescado. En este sentido, la inclusión de una etapa de purificación en el protocolo de preparación de muestra mejoró la sensibilidad del ensayo, así como la fiabilidad y reproducibilidad de las semicuantificaciones. La combinación del ensayo N2a-MTT con el fraccionamiento HPLC-UV facilitó la identificación de C-CTX1 como principal responsable de la contaminación en las regiones costeras de la Macaronesia, además de resultar una herramienta muy valiosa que permitió identificar la presencia de otros congéneres de C-CTXs. Por su parte el ensayo celular permitió descartar la contribución de la C-CTX1 a la toxicidad de las cepas de Gambierdiscus australes, permitiendo asociar la toxicidad a análogos de MTX. La optimización del ensayo celular N2a-MTT desarrollado en este estudio permitió disponer de una herramienta muy valiosa para la confirmación de la eficacia del procedimiento diseñado para la extracción y purificación de C-CTX1 a partir de muestras de pescado naturalmente contaminadas.