Nanovacunas y lipoplexos para prevención y terapia

Resum

La Nanomedicina es la ciencia que estudia la aplicación de los conocimientos y herramientas de la Nanotecnología para el diagnóstico, monitorización, control, prevención y tratamiento de enfermedades. Dentro de los campos preventivo y terapéutico destaca el desarrollo de nuevas vacunas. La vacunación frente a infecciones consiste en un proceso de inmunización activa que pretende generar una respuesta inmunitaria que proteja frente a un patógeno concreto. Del mismo modo, las vacunas para el tratamiento de un cáncer presentan antígenos tumorales que conllevan a la activación de las células inmunitarias (principalmente a los linfocitos T) para que puedan reconocer y destruir a las células tumorales. Las nanovacunas han mostrado diversas ventajas en comparación a las vacunas tradicionales. Además de ofrecer una gran diversidad tanto en morfología como en tamaño, los nanomateriales (NMs), dado su tamaño nanométrico, incrementan la superficie para la incorporación del antígeno deseado. Para potenciar la respuesta inmunitaria, y aunque los propios NMs pueden presentar propiedades inmunoestimulantes intrínsecas, es común añadir a la formulación compuestos adyuvantes que actúen como sistemas de liberación o como inmunoestimuladores. Los NMs son capaces de mejorar la solubilidad de compuestos hidrofóbicos, lo que permite el uso de antígenos y adyuvantes más diversos, además de proteger al antígeno contra la degradación. Gracias a su similitud con patógenos (virus o bacterias), pueden ser fácilmente reconocidos por parte de las células, siendo eficazmente captadas por las células presentadoras de antígenos. Asimismo, constituyen un reservorio que permite una liberación controlada y gradual en el lugar de administración, favoreciendo la biodisponibilidad y la reducción del número de dosis necesarias para la generación de una respuesta inmunitaria. También posibilitan su aplicación a través de nuevas rutas de administración, más sencillas e indoloras, como a través de la mucosa. La vacunación constituye una estrategia que ha mostrado buenos resultados en el tratamiento y prevención de diversas enfermedades. Sin embargo, existen infecciones y tumores para los que todavía no ha sido posible el desarrollo de una vacuna eficaz debido a su complejidad, como es el caso de la tuberculosis y el cáncer de páncreas. TUBERCULOSIS La tuberculosis (TB) es la segunda enfermedad infecciosa transmisible más mortífera a nivel mundial y es causada por el bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Presenta una elevada incidencia, ya que se estima que un tercio de la población mundial se encuentra infectada, aunque solo un 10% llegará a desarrollar la forma activa de la enfermedad. Su principal vía de transmisión es la vía aérea, mediante la inhalación de gotas de Flügge que contienen los bacilos tuberculosos. Una vez inhalados y alojados en el espacio alveolar, pueden ser fagocitados y destruidos por los macrófagos alveolares residentes; o pueden evitar su destrucción e invadir el tejido intersticial pulmonar. En este último caso, las células dendríticas (DCs) transportan a las bacterias o a sus fragmentos peptídicos a los ganglios linfáticos pulmonares y se inicia el reclutamiento de los linfocitos T cooperadores y citotóxicos (Th y Tc, respectivamente) que culmina con la formación de una estructura fibrótica denominada granuloma. Esta puede ser suficiente para contener al patógeno, pero, en ocasiones, dado que las bacterias pueden seguir replicándose en el interior, éstas pueden diseminarse a otros órganos o reingresar al tracto respiratorio. En la respuesta inmunitaria frente a Mtb, además de los macrófagos, destacan los linfocitos T cooperadores de tipo 1 (Th1) que son capaces de producir las citocinas pro-inflamatorias IFN-γ y TNF-α. A su vez, estas citocinas activan a los macrófagos pulmonares, mejorando la actividad antimicrobiana en el lugar de infección. En la actualidad, la vacuna BCG (del inglés, Bacille Calmette-Guérin) es la única autorizada para la prevención de la enfermedad. Su eficacia es variable, y lo que es más importante, no protege de la forma pulmonar en adultos. La elevada incidencia de la TB en el mundo, así como el limitado impacto de la vacunación con BCG, ha promovido el desarrollo de nuevas vacunas. CÁNCER DE PÁNCREAS En el caso del cáncer de páncreas, el tipo más común es el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Se trata de un cáncer altamente letal que presenta una tasa de supervivencia a los 5 años inferior al 10%. Se ha descrito que los cambios genéticos en las células ductales están en el origen del desarrollo del cáncer pancreático. En presencia de una situación de inflamación y de la mutación del oncogén KRAS, las células acinares del páncreas sufren un proceso de reprogramación y re-diferenciación hacia células de tipo ductales. Con la adquisición de posteriores mutaciones se favorece la pérdida de senescencia y la desregulación del ciclo celular. Este incremento en la desmoplasia induce una direccionalidad hacia lesiones cancerosas y a su posterior diseminación a través de la circulación a otros órganos. Las mutaciones juegan un papel muy importante en el desarrollo del cáncer de páncreas, especialmente la mutación en el oncogen KRAS en la posición 12, la cual aparece en el 90% de los casos. Como consecuencia, la proteína KRAS se encuentra en estado activo y produce la activación de otras proteínas efectoras que culmina con la expresión de genes implicados en la supervivencia, proliferación celular, y metástasis. El PDAC se caracteriza por un estroma altamente fibrótico compuesto por fibroblastos asociados al cáncer (derivados de las células estrelladas pancreáticas), colágeno, fibronectina y ácido hialurónico, que genera un ambiente hipovascular. En las etapas iniciales se observa una cantidad de macrófagos, linfocitos Tc y células asesinas naturales (NK) que llevan a cabo la lisis de las células tumorales con un microambiente estimulador (DCs, linfocitos Th1) favoreciendo una respuesta anti-tumoral. A medida que las células tumorales proliferan, se contribuye a un ambiente inmunosupresor con infiltración de células inmunosupresoras, como células mieloides supresoras y linfocitos T reguladores. Cabe mencionar que algunas proteínas implicadas en la progresión tumoral, como son las proteínas antígeno 1 similar a Fos (FOSL-1) y la proteína asociada a Yes (YAP) se encuentran sobreexpresadas en este tipo de tumor. La proteína FOSL-1 favorece el ambiente inmunosupresor característico del cáncer pancreático, y como consecuencia tiene relevancia en el proceso de tumorogénesis y proliferación celular. Además, cabe destacar que sinergiza con la otra proteína diana propuesta, YAP, formando un complejo transcripcional. El coactivador transcripcional YAP forma parte de la vía Hippo, la cual cuando se encuentra inactiva, YAP se transloca al núcleo e induce la activación de varios genes implicados en la progresión tumoral y en la inhibición de la apoptosis. En la actualidad, la única terapia disponible es la resección quirúrgica en combinación con quimioterapéuticos como la Gemcitabina, el Nab-paclitaxel y el FOLFIRINOX (Ácido folínico, 5-Fluorouracilo, Irinotecan y Oxaliplatino) y la radioterapia. Dado que la eficacia de estos tratamientos es insuficiente para aumentar la tasa de supervivencia, es necesario la búsqueda de nuevas terapias. Junto a la vacunación, otra estrategia a explorar es la terapia génica, como el empleo de ARN pequeño de interferencia (ARNip) dirigido frente a los ARNs diana. Para proteger dichos ARNip es necesario el empleo de estructuras tales como los liposomas, que deben ser, al igual que las nanovacunas, biocompatibles y biodegradables. Teniendo en cuenta las ventajas que ofrecen los NMs, en la presente Tesis Doctoral se han desarrollado nuevas vacunas basadas en nanocápsulas (NCs) poliméricas, utilizando el imiquimod (IMQ) como adyuvante, para enfermedades que en la actualidad no presentan una prevención o cura eficaz, como son la tuberculosis (Capítulo I) y el cáncer de páncreas (Capítulo II). El IMQ a través del TLR-7 inicia una respuesta inmunitaria con la liberación de citocinas pro-inflamatorias como TNF-α, INF-α o IL-6 y IL-12, las cuales van a favorecer una respuesta celular mediada por linfocitos Th1. En el caso del cáncer pancreático, debido a su elevada complejidad, se planteó una terapia complementaria basada en el silenciamiento génico de proteínas implicadas en la tumorogénesis utilizando liposomas con ARNip (lipoplexos) (Capítulo III). - CAPÍTULO I Dado que la principal vía de entrada y diseminación de la Mtb es el aire, la mucosa juega un papel fundamental en la defensa frente a este agente infeccioso. Por ello, es importante conseguir una administración a través de la mucosa (como la vía intranasal) y la generación de una respuesta tanto a nivel local, como sistémico. En este capítulo se ha evaluado la eficacia de tres prototipos de nanovacunas basadas en NCs poliméricas. Constan de un núcleo oleoso de miglyol y ácido linolénico, donde se encuentra embebido el adyuvante IMQ. Como cubiertas poliméricas se eligieron los polímeros quitosano (CS) o inulina (INU)/poliarginina (pArg) que, gracias a sus propiedades mucoadhesivas, favorecen el tiempo de residencia del antígeno y la liberación a largo plazo, potenciando su efecto. Finalmente, como inmunógeno se seleccionó la proteína de fusión ECH, compuesta por las proteínas ESAT-6 y CFP-10 de la Mtb. Estas proteínas se encuentran implicadas en la virulencia de la micobacteria, y, además, podrían estar involucradas en la apoptosis de los macrófagos durante la fase infectiva de la enfermedad. Asimismo, el complejo proteico ESAT-6/CFP-10 no se encuentra presente en la vacuna BCG. El antígeno se agregó sobre la superficie de la cubierta polimérica (CS:Ag o INU:pArg:Ag) o entre las capas poliméricas (INU:Ag:pArg), con el fin de evaluar la influencia de la posición del antígeno en la respuesta inmunitaria. Se llevaron a cabos estudios para la caracterización físico-química de los prototipos, el potencial inmunoestimulante in vitro y citocompatibilidad, así como la capacidad para inducir una respuesta inmunitaria in vivo. Todos los prototipos mostraron una población homogénea con un tamaño de 150 nm y con una carga superficial positiva que ayudaría a la interacción con la mucosa. En cuanto a la estabilidad, para asegurar una buena interacción entre los polímeros y el antígeno, la proteína de fusión debería añadirse próximo al momento de administración. Las NCs fueron citocompatibles a bajas concentraciones (100 – 200 µg/mL), siendo las NCs de INU/pArg el prototipo más tóxico en las diferentes líneas celulares. En relación con la interacción con los componentes sanguíneos, las NCs de CS mantuvieron un perfil de seguridad mientras que las NCs de INU/pArg mostraron una elevada hemólisis e interacción con la cascada de coagulación. En cuanto a la inmunogenicidad in vitro, las NCs de CS mostraron un mayor efecto, ya que fueron capaces de inducir la activación de la cascada del complemento a 200 µg/mL y la producción de especies reactivas de oxígeno a 50 µg/mL. Además, a 100 µg/mL, este prototipo mostró capacidad de inducir la liberación de algunas citocinas en células mononucleares de sangre periféricas humanas (hPBMCs) como IL-6, IL-10, TNF-α, IL-1β e GM-CSF. Finalmente, la inmunogenicidad de los prototipos de vacunas por vía intranasal se probó en ratones previamente inmunizados subcutáneamente o no con la vacuna BCG, para probar la sinergia entre ambas vacunas. Los resultados in vivo mostraron la producción de anticuerpos tanto a nivel sistémico (IgG) como a nivel local (IgA) frente a los antígenos diana, destacando las NCs de INU/pArg con la proteína ECH en la superficie (INU:pArg:Ag) en la producción de IgA. El antígeno ESAT-6 mostró ser el más eficiente en la inducción de anticuerpos específicos. Además, se observó que todos los prototipos fueron capaces de liberar INF-γ e IL-17 tras la reestimulación de los esplenocitos. La inmunización previa con BCG aumentó la respuesta inmunitaria de las NCs de CS, pero, por el contrario, la disminuyó en los prototipos de INU/pArg. Aunque las NCs de INU/pArg con el antígeno en la superficie fueron capaces de inducir una mejor respuesta en mucosa, las NCs de CS parecen ser las mejores candidatas para la vacunación intranasal debido a su mayor biocompatibilidad, y a su buena inmunogenicidad in vitro e in vivo y la posibilidad de usarla en combinación con la vacuna BCG. - CAPÍTULO II En este capítulo se desarrolló una vacuna anti-tumoral frente al PDAC empleando como diana a la proteína KRAS. La nanovacuna se basó en las NCs poliméricas de CS que mostraron una buena respuesta Th1 y una buena citocompatibilidad en el Capítulo I. El antígeno diana consistió en la mezcla de tres péptidos portadores de la mutación KRASG12V diseñados para inducir una buena respuesta inmunitaria. Además, como control de eficacia se empleó una vacuna “comercial” de la empresa Targovax que consiste en una combinación de péptidos mutados de la proteína KRAS y el factor estimulante de colonias granulo-monocíticas (GM-CSF). Las vacunas, administradas subcutáneamente, se testaron en ratones C57BL/6 en un modelo subcutáneo con una línea pancreática murina que portaba la mutación (KrasG12V and p53 knockout). De entre las tres líneas celulares disponibles, la línea celular ATQ303G fue seleccionada para llevar a cabo la inducción tumoral, ya que fue la que mostró una cinética de crecimiento tumoral más homogénea. Las NCs de CS, tanto solas como con los péptidos, mostraron una buena homogeneidad, un tamaño medio de 178 nm y una carga superficial positiva que podría favorecer su internalización por las células presentadoras de antígeno y su drenaje a los nódulos linfáticos cercanos. Se evaluó la eficacia anti-tumoral de la nanovacuna mediante el análisis de la inmunogenicidad y la reducción del volumen tumoral. Nuestra nanovacuna se testó tanto sola como en combinación con la vacuna TG02 de la empresa Targovax. Con el objetivo de conseguir una mayor eficacia, las distintas mezclas de péptidos fueron añadidas a la superficie de las NCs justo antes de llevar a cabo las inmunizaciones. Se llevaron a cabo estudios de eficacia anti-tumoral de manera preventiva, así como terapéutica. En el caso de la vacunación profiláctica, nuestro prototipo de nanovacuna no mostró una mejoría respecto al grupo control vacunado con PBS a tiempos largos. Aunque la mayor tasa de supervivencia se obtuvo en el grupo de ratones inmunizados con la vacuna TG02, su combinación con nuestra nanovacuna consiguió mejorar notablemente la eficacia a tiempos cortos. A nivel de terapia, nuestro prototipo de vacuna, no mostró beneficio respecto al grupo control. El estudio del infiltrado inmunitario en los tumores mostró una gran heterogeneidad celular entre los distintos grupos, destacando el incremento de las células T reguladoras en los grupos inmunizados con nuestro prototipo (CS+3p o CS+3p+TG02). La presencia de estas células reguladoras podría ser la causante de la baja eficacia anti-tumoral, sobre todo a tiempos largos. Además, las NCs de CS in vitro mostraron una polarización de los macrófagos hacia un fenotipo M2, lo cual podría estar favoreciendo un ambiente anti-inflamatorio. Las NCs de CS conteniendo tres péptidos mutados específicos KRASG12V, promovieron un ambiente pro-tumoral que se traduce en una ausencia de eficacia terapéutica. No obstante, como vacuna preventiva, potenciaron la eficacia terapéutica de la vacuna TG02 de la empresa Targovax. - CAPÍTULO III En este capítulo, se propuso el uso ARNip para inhibir la expresión combinada de las proteínas FOSL-1 y YAP. Se diseñaron dos ARNip específicos para cada proteína, y para mejorar la eficacia de la transfección celular, se emplearon liposomas como nanotransportadores, formando los denominados lipoplexos. Se emplearon liposomas catiónicos compuestos por el lípido catiónico dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) y el lípido neutro 1-monooleoyl-rac-glicerol o monoleína (MO) a dos ratios molares distintos (2:1) y (1:2). La caracterización físico-química de los liposomas mostró que ambos prototipos presentaron una población homogénea con tamaño medio de 140 nm y carga superficial positiva que favorece la interacción con el ARNip. La encapsulación del ARNip en los liposomas mostró buena eficacia, y a partir de los datos de la hemocompatibilidad (activación del complemento, hemólisis y coagulación) y citocompatibilidad se determinó que el mejor prototipo para la generación de lipoplexos era el DODAB:MO (1:2). Los liposomas DODAB:MO (1:2) fueron cargados con cargados con ARNip para formar tres tipos de lipoplexos: dos individuales (Fosl1+2 o Yap1+2) y uno combinado (Fosl1+2+Yap1+2). Las dosis empleadas in vitro e in vivo fueron 50 nM o 2 µg de ARNip total, respectivamente. Los lipoplexos demostraron un ralentizamiento del crecimiento sobre las células tumorales pancreáticas de ratón ATQ303G (KrasG12V and p53 knockout). Los estudios in vivo fueron realizados en ratones atímicos (Athymic Nude-Foxn1nu) y en inmunocompetentes (C57BL/6). La disminución en la proliferación celular se atribuyó al silenciamiento de YAP y FOSL-1, que fue comprobado mediante estudios de los niveles de ARNm y de proteína. Aunque el silenciamiento de las proteínas individualmente mostró resultados prometedores en animales atímicos (tanto en el tamaño tumoral, como en la expresión de ARNm), la inhibición conjunta de ambas proteínas (FOSL-1 y YAP) fue la que indujo un mayor control sobre el crecimiento tumoral en comparación con los tratamientos individuales en ambos modelos murinos, indicando que la eficacia antitumoral no estaba favorecida ni inhibida por el sistema inmunitario. Además, estudios histológicos de los tumores mostraron una reducción del estroma tumoral y un incremento en el número de células apoptóticas en aquellos animales tratados con los lipoplexos. Ya que este efecto en la disminución del estroma podría favorecer el uso de terapias complementarias como la quimioterapia, se realizó un ensayo de sinergia entre los lipoplexos y la Gemcitabina. A tiempos cortos se observó un potente efecto sinérgico que podría abrir la puerta a emplear menos dosis del fármaco y con ello reducir los potenciales efectos secundarios derivados del mismo. El silenciamiento de YAP y FOSL-1 con lipoplexos mostró ser una terapia efectiva, aunque no consiguió eliminar completamente el tumor. Sin embargo, podría favorecer la quimio- o la inmunoterapia frente al PDAC gracias al control sobre la proliferación tumoral y a la reducción del estroma, permitiendo la llegada de fármacos antitumorales y células inmunitarias. Los resultados obtenidos en este trabajo ofrecen un nuevo enfoque terapéutico para el tratamiento del cáncer de páncreas.