"Genómica poblacional de la adaptación paralela en el caracol marino ""Littorina saxatilis"""

Résumé

Distinguir la manera mediante la cual la selección divergente produce el aislamiento reproductivo es uno de los grandes retos del estudio de la especiación ecológica. Como todavía se sabe muy poco de los genes implicados en los fenómenos de adaptación y de especiación, esta tesis propone elucidar la base molecular del aislamiento reproductivo y el mecanismo por el cual la selección natural genera nuevas especies. Para ello se ha llevado a cabo el estudio en un caso de especiación ecológica incompleta: el caracol marino Littorina saxatilis. Esta especie presenta dos ecotipos viviendo a diferentes niveles de la costa gallega y parcialmente aislados reproductivamente. El ecotipo RB vive en la parte alta del intermareal y es capaz de resistir el estrés de la desecación y la temperatura, mientras que el ecotipo SU es de menor tamaño y es capaz de soportar directamente fuertes perturbaciones físicas, como la acción de la marea. Un resultado sorprendente de este sistema es que estos ecotipos han surgido en simpatría de forma independiente y repetida a lo largo de la costa gallega en respuesta a un mismo gradiente ambiental. Aunque ya se han realizado estudios previos a nivel ecológico, morfológico y genómico, desconocemos las bases genómicas de los cambios fenotípicos adaptativos. Tampoco disponemos de información sobre cómo la selección natural divergente podría haber afectando a los genomas de estos ecotipos tanto a una escala evolutiva corta como larga, o en qué medida los cambios en la expresión de los genes podrían ser debidos a la selección natural adaptativa. Es por ello que se desarrolló este trabajo en el que, mediante la utilización de técnicas ómicas, se caracterizó el impacto genómico de la selección natural mediante el estudio de los patrones de polimorfismo y variación en secuencia y su relación con los niveles de expresión génica en poblaciones en las que estos ecotipos han surgido de forma repetida e independiente. Una limitación de los estudios realizados hasta la fecha en este gasterópodo marino es que se basan en regiones no codificadoras y/o marcadores considerados a priori como neutrales (microsatélites, ADN mitocondrial) o con un bajo contenido informativo debido a su naturaleza dominante (AFLPs). Esta tesis se centra en la parte codificante del genoma y combina de forma exhaustiva técnicas de última generación para poder estudiar la variación en secuencia y expresión de miles de genes y cientos de individuos de distintas poblaciones y localidades, con el objetivo de determinar el papel de la selección natural en la adaptación y la especiación simpátrida en L. saxatilis. Además, a diferencia de otros estudios que se limitan a identificar marcadores genéticos anónimos susceptibles de estar influidos por la selección, este trabajo utiliza un enfoque en el que se combinan la genómica poblacional y funcional con el objetivo de determinar qué genes concretos podrían estar involucrados en los procesos de adaptación y especiación. La primera parte de esta tesis se ha centrado en la caracterización del transcriptoma de los ecotipos gallegos de L. saxatilis mediante la secuenciación de la parte codificante del genoma (RNA-Seq), con el fin de elucidar las adaptaciones locales ocurridas en las poblaciones de L. saxatilis. Gracias a este experimento, se ha detectado un 0,36% de isotigs con diferencias de expresión entre los ecotipos RB y SU tras la correción multitest BH (Benjamini & Hochberg). Además, cerca de un 18% de estos isotigs fueron anotados e identificados, como por ejemplo el isotig que codifica la proteína perlucina. Esta proteína compleja podría estar implicada en la formación y crecimiento de la concha, permitiéndole a los moluscos obtener un tamaño de concha más grande. El gen de la perlucina no se expresa en el ecotipo SU (poblaciones que habitan en la zona baja del intermareal y que son de menor tamaño que los individuos RB), por lo que su expresión en el ecotipo RB posiblemente le permita alcanzar su mayor tamaño, una característica que mejora la adaptación a su entorno y favorece el aislamiento reproductivo. Han sido identificadas otras proteínas involucradas en la contracción muscular, como la miosina y la twitchin, sin obtener datos de sobreexpresión que apoyen la teoría comúnmente aceptada de que el ecotipo SU requiere un mayor metabolismo energético y un aumento en el nivel de energía disponible como ATP para resistir el fuerte oleaje que es característico de su hábitat natural. Gracias a este experimento se ha aumentado considerablemente la anotación de genes funcionales en L. saxatilis que había hasta el momento. Además, la secuenciación del transcriptoma ha permitido detectar una batería de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) potencialmente implicados en las diferencias fenotípicas y en los procesos de adaptación y especiación incipiente de los ecotipos RB y SU, útiles para futuros estudios de adaptación ecológica. El hecho de que los pares de ecotipos divergentes de L. saxatilis ocupen hábitats contrastados en distintas regiones geográficas no es suficiente para inferir origen paralelo y desconocemos en qué medida esta evolución fenotípica paralela es el producto de una evolución genética paralela y su escala a nivel genómico. Por ello, la segunda parte de esta tesis está orientada al uso de la tecnología de los microarrays para estudiar la base molecular de la evolución paralela de los ecotipos RB y SU en tres localidades alejadas geográficamente. Los microarrays se han utilizado tanto para escanear el transcriptoma como el genoma, interpretando las distintas intensidades de señal de hibridación como expresión génica (en el caso de transcriptómica) o como variación en secuencia genómica o número de copias (en el caso del escaneo genómico). Siguiendo la misma estrategia que en el primer capítulo, se compararon las diferencias de expresión génica y de variación en secuencia genómica entre ecotipos de una misma localidad, añadiendo la comparación entre distintas localidades (Silleiro, Roncudo y Burela) para intentar inferir evolución paralela. Las diferencias de expresión y de secuencia encontradas fueron mayores entre localidades que entre ecotipos, lo que sugiere que las localidades surgieron antes que los ecotipos, conforme a lo esperado bajo un modelo de evolución paralela. Además, los resultados mostraron una mayor diferenciación en expresión génica (22,2 %) que en variación en secuencia genómica (7,5%) entre ecotipos, sugiriendo la actuación de factores evolutivos y/o ambientales de mayor intensidad en el transcriptoma. A su vez, 146 genes y 354 sondas (sobre un 0,80% y un 0,30% de todos los genes/sondas estudiados) mostraron cambios paralelos en las tres localidades (genes candidatos), usando el filtrado por señal y la corrección multitest SGoF. Estos bajos porcentajes sugieren que la historia demográfica de las localidades es parcialmente independiente, pero a su vez el patrón de variación de los genes candidatos podría ser el fruto de la acción de la selección adaptativa convergente en respuesta a un similar gradiente ambiental en las distintas localidades analizadas. La naturaleza adaptativa de los genes candidatos es también consistente con el hecho de que la diferenciación geográfica de estos genes es muy superior a la observada en los genes que no presentaron diferencias entre ecotipos dentro de cada localidad, y por tanto éstos últimos serían más susceptibles de evolucionar de forma neutral. La mayoría de los genes con cambios paralelos presentaron cambios direccionales (90% de cambios direccionales en los datos de expresión y un 83% en variación en secuencia genómica), perteneciendo a diferentes grupos funcionales asociados al crecimiento de la concha y la resistencia al estrés, entre otros, que podrían desempeñar un importante papel en la adaptación a los ambientes extremos que habitan estos ecotipos. Además, solamente 13 genes mostraron cambios paralelos direccionales tanto en expresión como en secuencia genómica, lo que denota una marcada falta de dualidad entre ambos niveles, por lo que se deduce que los cambios paralelos producidos en regiones reguladoras o efectoras actúan sobre genes diferentes. De estos 13 genes se pudo identificar dos de ellos, asociados a la codificación de la tubulina y al sistema hormonal. En el experimento de los microarrays se han encontrado muchos más genes que podrían estar implicados en la adaptación local (genes outliers específicos de localidad) que genes implicados en la evolución paralela, sugiriendo que hay pocos genes que se expresan de la misma manera en las distintas localidades simultáneamente, por lo que los cambios evolutivos en especies sometidas a presiones selectivas similares podrían ser no predecibles. Referente a los genes outliers, no se ha encontrado ninguna correlación entre sus anotaciones funcionales entre las distintas localidades. Solamente se observa en la localidad de Burela un mayor número de genes relacionados con el metabolismo energético. De todas formas habría que secuenciar los genes outliers y aplicar tests de neutralidad para comprobar realmente si la selección está actuando sobre estos genes en cada localidad. En esta tesis se encontraron una serie de evidencias que refuerzan el papel central de la selección en L. saxatilis, es decir, la selección natural divergente como generadora de las diferencias morfológicas, ecológicas y de comportamiento que se observan entre los ecotipos y localidades. Una de estas evidencias es la menor varianza encontrada en los genes con cambios paralelos direccionales comparada con la de los no direccionales. De todas formas, no se puede descartar una posible actuación de procesos estocásticos, ya que la selección natural divergente podría estar co-actuando con la deriva genética en las poblaciones analizadas de L. saxatilis. Es por ello que, en la última parte de esta tesis, se desarrolla un método de detección de selección natural divergente en especies no modelo. Como L. saxatilis se encuentra bajo un escenario muy peculiar (es decir, poblaciones sometidas a selección divergente y con flujo génico entre ellas), no existen métodos que de forma explícita modelicen el impacto de la selección bajo este tipo de escenario evolutivo. El funcionamiento del nuevo método propuesto se analizó mediante la simulación por ordenador de genomas de individuos diploides pertenecientes a dos poblaciones sometidas a selección divergente y utilizando estimas empíricas de parámetros demográficos. Los datos simulados permitieron determinar y comparar la potencia estadística del nuevo método propuesto para detectar selección natural, mostrando un comportamiento parecido al de estadísticos similares, con la notable mejoría de que el estadístico propuesto puede aplicarse a especies de las que no se tenga información suficiente de sus filogenias. Además, se observó un efecto de la posición nucleotídica sometida a selección sobre la capacidad de algunos métodos de detectar selección, encontrando que, cuanto más alejada esté la posición selectiva de los extremos del genoma, más eficientes y precisos son los métodos a la hora de detectar selección en dicha posición. En conclusión, se ha conseguido identificar y anotar un importante número de genes codificadores potencialmente adaptativos, combinando diferentes herramientas para investigar varios niveles moleculares (variación en el transcriptoma y el genoma), con el fin de determinar cuáles son los principales mecanismos moleculares que conducen fenómenos tan importantes como son la especiación y evolución paralela. Además, se ha conseguido desarrollar un estadístico mejorado para la detección de selección divergente en especies no modelo