Generación y aplicación de anticuerpos monoclonales frente a toxinas marinas y al dinoflagelado alexandrium minutum

Resumo

Con el fin de disminuir las pérdidas económicas sufridas en acuicultura y el alto riesgo para la saludo de los consumidores, ocasionados por episodios tóxicos provocados por distintas especies de fitoplancton marino, diversos países han implementado medidas de control. Las cuales incluyen, el recuento de fitoplancton tóxico y el control de toxinas en marisco. El control de fitoplancton tóxico se lleva a cabo mediante la identificación de las características morfológicas bajo microscopio óptico, tarea lenta y tediosa que requiere personal entrenado. El control de toxinas en marisco tiene como objetivo asegurar que no se superen los límites legales permitidos, para lo cual se han establecido métodos oficiales de detección. Sin embargo, algunos de estos métodos, como el bioensayo en ratón, presentan importantes desventajas. Con el fin de facilitar los programas de control planteamos en este trabajo tres grandes objetivos. En primer lugar, la inmunodetección de microalgas con anticuerpos monoclonales obtenidos mediante la técnica de producción de hibridomas, dirigidos frente al dinoflagelado Alexandrium minutum. De los 12 hibridomas obtenidos, dos (M54,3 y M90.3) mostraron gran especifidad frente al dinoflagelado, reconociéndolo exclusivamente tanto en muestras de cultivo, como en muestras naturales de fitoplancton procedentes de episodios tóxicos. Por lo que su su aplicación podría facilitar las tareas de monitorización. En segundo lugar, nos planteamos la inmunodetección de las toxinas marinas Ácido domoico (AD) y Palitoxina (PITX) mediante la obtención de fragmentos de anticuerpos a partir de bibliotecas de fagos recombinantes. Se obtuvieron virus bacteriófagos portadores de fragmentos scFvs capaces de reconocer al ácido domoico ELISA indirecto. Sin embargo no fueron efectivos en el desarrollo de un ELISA competitivo para la cuantificación de la toxina. De los 20 fagos-scFvs obtenidos, capaces de reconocer a la palitoxina en alta intensidad, se seleccionaron los que presentaron mayor absorbancia por ELISA indirecto. Tras analizar sus secuencias nucleotídicas, se seleccionó un único clon, denominado PITx8. Este fago-scFv fue utilizado en el desarrollo de un ELISA competitivo como posible método de detección de palitoxina en muestras contaminadas. Tras enfrentar al fagoPTX8 a un amplio rango de concentraciones decrecientes de palitoxina libre, se obtuvo una recta de calibrado con un coeficiente de regresión de 0,9945, que permitiría la estimación de toxina presente en una muestras, dentro de un amplio rango de cuantificación (0,0005-500ng/ml). La aplicabilidad de éste método se conformó mediante el análisis de 10 muestras de marisco artificialmente contaminadas con Palitoxina patrón, encontrándose que el método fue capaz de determinar la concentración de toxinas en todos los casos. Por último, se llevó a cabo un ensayo comparativo entre los métodos de referencia para la detección de toxinas amnésica (AD y derivados) y paralizantes (Saxitoxina y derivados ) y el inmunoensayo. Tras analizar 80 muestras naturalmente contaminadas con toxinas paralizantes, provenientes de nueve especies distintas de marisco bajo varias presentaciones, mediante el bioensayo en ratón y un ELISA comercial, se observó que el 90% de las muestras fueron correctamente determinadas por ELISA. La correlación entre ambos métodos mostró una buena concordancia entre ellos. En cuanto a las toxinas amnésicas se analizaron 58 muestras naturalmente contaminadas con un amplio rango de concentraciones, provenientes de seis especies de marisco, bajo distintas representaciones. Se compararon los resultados mediante el método de referencia (HPLC-UV) y el ELISA competitivo ASP (modelo oficial alternativo), encontrándose que el ELISA fue capaz de determinar correctamente el 97 % de las muestras, confirmando que este método es una alternativa útil, que permite la detección de AD en distintas especies de marisco, bajo distintas presentaciones.