Estudio y desarrollo de nuevas herramientas para la exploración de ambientes extremos

Resumo

El uso de enzimas y biomoléculas procedentes de organismos procariotas se ha convertido en una parte clave de un amplio espectro de procesos industriales y del área de la biomedicina, así como de numerosas herramientas biotecnológicas. Dentro de estos microorganismos, los denominados extremófilos, y en especial los termófilos, son una de las principales fuentes de nuevos recursos, debido a que su adaptación a ambientes hostiles ha conferido a sus enzimas algunas propiedades muy relevantes para estos procesos. Por esta razón, la búsqueda de nuevas enzimas o biomoléculas procedentes de estos organismos es altamente demandada, empleándose principalmente organismos mesófilos modelo para su búsqueda y producción. Dado que una parte muy significativa de las enzimas codificadas en microorganismos termófilos no se pueden producir en forma activa en estos modelos, se han seleccionado organismos termófilos como modelos y desarrollado las metodologías para su uso en el laboratorio. Entre los pocos modelos de termófilos existentes destaca Thermus thermophilus, un termófilo extremo perteneciente a un filo ancestral que se ha empleado en este trabajo, pero hay otros grupos filogenéticos de gran interés para los que se carece de modelos termófilos. Ejemplo de ello son las actinobacterias, de las que, a pesar de su relevancia biológica y biotecnológica, apenas se conocen aislados termófilos, uno de los cuales ha sido estudiado en esta tesis. Además de la necesidad de nuevos modelos que permitan una más amplia expresión de enzimas termoestables, la búsqueda eficaz de éstas a partir de DNA de ambientes extremos demanda una enorme capacidad de cribado, lo que ha llevado al desarrollo de nuevos métodos de alto rendimiento que permitan explorar estos ambientes inhóspitos de forma rápida y a bajo coste. En esta categoría destacan las técnicas basadas en la microfluídica, que permite la generación de miles de compartimentos por segundo que actúan como reactores independientes de muy pequeño volumen. En esta tesis doctoral se intenta aunar estas necesidades mediante varias aproximaciones. En el contexto biológico, se ha estudiado Mycolicibacterium hassiacum (antes Mycobacterium hassiacum), del filo Actinobacteria, para su implementación como nuevo modelo termófilo de laboratorio. Su estudio se compone de dos secciones. A nivel de genoma, éste se ha secuenciado y su cromosoma circularizado. Asimismo, se ha llevado a cabo su anotación y la asignación funcional de los genes detectados, junto con la evaluación de su organización y la determinación de algunos elementos remarcables, como secuencias de inserción o agrupamientos CRISPR. Durante su desarrollo se ha observado la generación de errores sistemáticos en las lecturas de la secuenciación por PacBio Bioscience, que se han asociado a homopolímeros de G y de C. En el ámbito práctico, se ha analizado su cultivo en condiciones de laboratorio y se ha desarrollado la metodología para su manipulación genética mediante transformación, así como la necesaria para la obtención de mutantes knock-out dirigidos por recombinación homóloga, lo que ha resultado en la alteración de la ruta de degradación de fitoesteroles. Dicha ruta presenta alta implicación industrial, con intermedios metabólicos que son precursores de importantes ingredientes farmacéuticos activos (APIs). En el ámbito técnico, se han desarrollado los flujos de trabajo para el cribado funcional de metagenotecas en experimentos de célula única usando T. thermophilus como hospedador con técnicas de microfluídica. En el trabajo se presentan dos aproximaciones, dependiente e independiente de crecimiento celular en el interior de microgotas de agua en aceite, de las que se han estudiado de forma individualizada las etapas que las componen. Estas etapas abarcan el encapsulado de células individuales, el cultivo opcional de T. thermophilus, su lisis, el seguimiento de las reacciones enzimáticas y la recuperación de la información genética asociada, todo ello llevado a cabo en microgotas de agua en aceite (w/o). Además, se ponen de manifiesto los obstáculos encontrados y las alternativas para afrontarlos. Finalmente, los protocolos desarrollados se aplican en el cribado de metagenotecas de ambientes extremos, habiéndose logrado los primeros clones con potencial actividad β-galactosidasa. Por último, también para la exploración de ambientes extremos, pero no focalizada en los microorganismos termófilos, se ha estudiado el uso de Saccharomyces cerevisiae como modelo para la búsqueda de inhibidores de las fosfoinositol 3-quinasas (PI3K) humanas con microfluídica. En este contexto, se ha confirmado el potencial del uso de un sensor basado en S. cerevisiae para detectar la presencia de inhibidores de PI3K, mediante una cascada de señalización ligada a la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP). También se han evaluado los requerimientos para el encapsulado de células individuales de esta levadura en microgotas de agua en aceite, incluyéndose soluciones para los diferentes cuellos de botellas encontrados. Asimismo, se ha llevado a cabo su cultivo, y el co-cultivo con células de Escherichia coli en microgotas. Para terminar, se ha analizado la compatibilidad de S. cerevisiae como reportero con el uso de cribados en microgotas, y se han planteado acciones para su utilización en procesos de cribado masivos.