In vitro culture of eryngium viviparuman endangered plant with therapeutic phytochemical potential

Resum

Las plantas son esenciales para muchos procesos vitales en la tierra; sin embargo, en los últimos años, su tasa de extinción ha alcanzado niveles nunca antes observados por la comunidad científica. Además de los muchos procesos clave para la vida en los que están involucradas, las plantas son fuente de múltiples metabolitos secundarios que pueden tener gran interés para el ser humano. Estos, son compuestos de bajo peso molecular que se sintetizan en bajas concentraciones a través de diferentes vías metabólicas y están involucrados en la defensa de la planta, resistencia al estrés y en su interacción con el entorno circundante. Además, estos metabolitos se han asociado con múltiples actividades biológicas importantes para la salud humana y su bienestar. Así, las plantas ricas en compuestos bioactivos se han utilizado durante décadas en la medicina tradicional y, más recientemente, se han aplicado en diferentes sectores, como la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética. Por tanto, las acciones coordinadas para la conservación de especies vegetales son una estrategia fundamental, tanto para preservar procesos vitales en los que están involucradas y que benefician directamente a la vida en la tierra, como para poder ser explotadas como fuentes alternativas y valiosas de compuestos bioactivos. Las medidas de conservación más utilizadas y eficaces son las que aseguran la protección de las especies vegetales dentro de su hábitat original. Estas medidas se denominan estrategias in-situ y permiten la preservación, a través de la protección de diversas regiones de particular interés, preservando las interacciones de las especies amenazadas con el resto del ecosistema. Debido a que estas estrategias pueden no ser efectivas, existen enfoques complementarios que ayudan a conservar la diversidad genética de la especie a medio y largo plazo en poblaciones con muy pocos individuos, que se encuentran en alto riesgo. Estas estrategias se denominan ex-situ y permiten preservar el material genético heterogéneo de poblaciones en peligro fuera de su hábitat natural. Generalmente, los jardines botánicos son los principales encargados de las estrategias ex-situ mediante la creación de bancos de semillas y colecciones vivas de estas especies. Adicionalmente, la aplicación de técnicas de cultivo in vitro es necesaria en ciertos casos amenazados para asegurar la conservación de una cantidad adecuada de germoplasma. Eryngium viviparum es la especie de estudio en la presente tesis. Esta especie es una planta amenazada perteneciente a la familia Apiaceae distribuida por humedales del noroeste de la Península Ibérica y Francia. Durante el invierno, esta especie vive sumergida dentro de estanques o lagos, y en verano cuando el nivel del agua disminuye, debido a las altas temperaturas, queda expuesta. Durante ese período, puede reproducirse sexualmente a través de estolones con formación de flores, que luego darán lugar a semillas y nuevas plántulas. Esta especie está considerada como "endangered" por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) y está incluida en su lista roja de especies amenazadas. Además, el Libro Rojo de la Flora Vascular Amenazada en España también incluye este endemismo. Ambas recopilaciones sobre el estado de amenaza de la especie coinciden en la necesidad de implementar medidas de conservación ex-situ para incrementar sus poblaciones. Según el Libro Rojo español, la situación actual de E. viviparum sugiere que el método de cultivo in vitro podría ser un buen enfoque para preservar su germoplasma e implementar programas de reintroducción con las nuevas plantas obtenidas para reforzar su hábitat original. En el caso de especies en peligro de extinción, la mejor opción para iniciar el cultivo in vitro es utilizar semillas permitiendo así, preservar la diversidad genética de las plantas resultantes. Adicionalmente, si las especies estudiadas pueden tener problemas de germinación, los métodos de germinación in vitro permiten mejorar la tasa de germinación en comparación con los métodos tradicionales. Asimismo, si la especie de estudio tiene pocas semillas disponibles o su tasa de germinación es muy baja, algunos autores recomiendan la propagación de las plántulas obtenidas a través de la germinación por micropropagación. Esta técnica multiplicará las plántulas obtenidas durante la germinación permitiendo obtener un mayor número de nuevas plantas. Con este incremento de material vegetal se puede fortalecer las poblaciones de los hábitats afectados (programas de repoblación), estudiar más a fondo la especie amenazada reduciendo la presión en su medio natural y / o preservar germoplasma in situ y colecciones vivas. En cuanto a su etnobotánica, E. viviparum no tiene ningún uso conocido. Sin embargo, pertenece a un género y familia (Apiaceae) muy conocido y utilizado en la medicina popular como remedio para diferentes enfermedades. En los últimos años, los estudios sobre las especies más utilizadas de esta familia han mostrado una correlación entre sus usos medicinales y sus compuestos bioactivos. Esto aumenta el interés por el cultivo in vitro de esta especie, ya que este tipo de metodología presenta varias ventajas, en comparación a las plantas cultivadas o salvajes, para la obtención de estas moléculas bioactivas. Las plantas cultivadas a través de esta técnica tienen concentraciones más altas de los metabolitos de interés y su producción puede limitarse y / o aumentarse en diferentes tejidos vegetales. Además, la producción de compuestos se puede llevar a cabo durante todo el año independientemente de la estación. Por tanto, esta tesis aborda el estudio de la germinación y micropropagación in vitro de E. viviparum, para implementar una estrategia de conservación ex situ que contenga como punto innovador la valorización de la especie a través del estudio de sus compuestos fenólicos y actividades biológicas asociadas, que puedan ser de interés para futuras aplicaciones industriales. Así, la primera parte de este trabajo estudió la germinación de E. viviparum a partir del conocimiento recogido en trabajos preliminares sobre esta especie y otros sobre la familia y el género. Estos trabajos exponían que las semillas de esta especie presentan bajos porcentajes de germinación, gran cantidad de semillas inviables y otras viables que exhiben varios grados de dormición. Se realizaron varios experimentos donde las semillas de E. viviparum fueron sometidas a diversos factores previamente estudiados, capaces de eliminar la latencia que pudiera presentar esta especie, y posteriormente se incubaron en múltiples condiciones que podrían mejorar el nivel de germinación. Para un estudio completo se necesitarían numerosos experimentos que contengan todos los factores probados y así, obtener un espacio de diseño bien muestreado y amplio para estudiar en las mejores condiciones el efecto de cada variable. Sin embargo, una de las limitaciones de este trabajo es la baja cantidad de semillas que se pueden recolectar en su hábitat, lo que restringe el espacio de diseño de la investigación. La estadística tradicional no consigue analizar bien estos resultados, sin embargo, a día de hoy existen herramientas de inteligencia artificial, como las redes neuronales (Neurofuzzy Logic en este caso), que analizan estos resultados con mayor precisión. Los resultados de este trabajo confirmaron la presencia de numerosas semillas no viables en E. viviparum (62,5%), una tasa similar a la de muchas especies de su género y familia. Estas semillas también presentaron la morfología típica exhibida por semillas no viables de su familia. Ambas morfologías carecen de embrión, pero mientras que unas tienen endospermo las otras están completamente vacías por dentro. Estas variaciones morfológicas se deben a que pueden ser infestadas por insectos (vacías) o pueden ser infértiles por su procedencia (autofecundación en la misma umbela). Otro resultado notable fue la evidencia de que las semillas de E. viviparum, al igual que muchas especies de su género, presentan un embrión subdesarrollado y, por tanto, dormición morfológica (DM). Para medir el efecto de los tratamientos utilizados sobre el desarrollo embrionario (necesario para germinar), utilizamos el ratio embrión: semilla (proporción entre la longitud del embrión y la semilla; ratio E:S). Esta proporción en las semillas de la población control (semillas sin tratamiento) fue de 0.31, similar a otras especies de la familia con DM. En cuanto al análisis estadístico, de los 9 factores iniciales Neurofuzzy Logic modeló los factores críticos y sus interacciones con alta predictibilidad y precisión (>75 R2). El modelo permitió reducir el número de factores iniciales, de 9 a 6, que consideró los más críticos, por explicar un gran porcentaje de variación de los resultados obtenidos. Además, permitió identificar las mejores condiciones para el desarrollo embrionario de E. viviparum y mejorar las tasas de germinación de las semillas, una vez eliminadas las semillas no viables. Las condiciones óptimas son las descritas: un breve período de estratificación a 25ºC, seguido de incubación a 24ºC, durante 20 semanas en medio de germinación suplementado con giberelinas (fitohormona). Por tanto, los resultados obtenidos indican que las semillas de E. viviparum, además de tener MD, podrían tener un componente fisiológico adicional. La dormición fisiológica (DF) retrasa aún más su germinación y, en consecuencia, una parte de la población de semillas puede presentar dormición morfofisiológica (DPM). Este componente fisiológico adicional debe ser eliminado para permitir el crecimiento del embrión y posteriormente, la germinación de la semilla. En los tratamientos más efectivos, la estratificación a 25ºC y posterior aplicación de giberelinas en el medio permitieron la rotura de este componente fisiológico. Esta eliminación permitió el crecimiento del embrión y la germinación después de la incubación a 24ºC, con un requisito de humedad, proporcionado por el medio de cultivo. La segunda parte de esta tesis tuvo como objetivo incrementar el rendimiento de las plantas germinadas de la fase anterior mediante micropropagación. Asimismo, se realizó una determinación preliminar de los compuestos fenólicos totales y flavonoides, así como su actividad antioxidante relacionada mediante técnicas colorimétricas en las plantas obtenidas durante el cultivo in vitro. El protocolo de micropropagación utilizado se llevó a cabo siguiendo las fases descritas en la bibliografía. En primer lugar, las plántulas germinadas se mantuvieron en un medio de establecimiento (medio Murashige & Skoog) para asegurar que crecían sin contaminación interna y se desarrollaban con normalidad dentro del medio. Las plantas establecidas, durante la fase de multiplicación, se introdujeron en un medio suplementado con diferentes concentraciones de reguladores del crecimiento y se midió el efecto de estos sobre la formación de nuevos brotes. Los medios utilizados estaban suplementados con una combinación de dos citoquininas, 6-bencilaminopurina o BAP y kinetina o KIN, a 3 concentraciones: 0, 1 y 2 mg L-1. Las plantas se trasfirieron cada 5 semanas a un nuevo medio (subcultivo) y en el quinto subcultivo, se comenzó un experimento paralelo para estudiar el alargamiento y enraizamiento de los brotes obtenidos. Durante este ensayo, se midió el impacto de la fuerza iónica del medio y el nivel de sacarosa (fuente de carbono) en el desarrollo y elongación de los brotes y raíces. Una vez enraizadas, las plantas se trasplantaron a macetas con turba y perlita, donde fueron aclimatadas a través de la reducción controlada de la humedad, que permite que las raíces y estomas de la planta proveniente del cultivo in vitro, vuelvan a ser funcionales. Durante la fase final de este ensayo se utilizaron los brotes formados durante la multiplicación para extraer los compuestos fenólicos. El extracto resultante se utilizó para determinar: el contenido de compuestos fenólicos totales mediante el método de Folin Ciocalteu; el contenido total de flavonoides por el método colorimétrico de cloruro de aluminio, y la actividad antioxidante por el método DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo). Respecto a los resultados obtenidos, en la fase de establecimiento, las plántulas provenientes de la germinación, sobrevivieron y se desarrollaron sin presentar contaminación. En la fase de multiplicación, los medios suplementados con 2 mg L-1 de BAP originaron el mayor número de nuevos brotes. Asimismo, la combinación con la KIN aumentó significativamente el número de nuevos brotes en comparación a los tratamientos que solo presentaban una citoquinina. Los medios suplementados con 2 mg L-1 BAP en combinación con 1 o 2 mg L-1 de KIN obtuvieron los mejores resultados con 5.1 y 5.8 nuevos brotes por plántula. En la etapa de elongación de brotes y enraizamiento, el medio de cultivo con la mitad de fuerza iónica y 2 % de sacarosa, fue el que mejores resultados tuvo en todos los parámetros medidos: alargamiento de brotes, longitud de raíz y peso seco de raíz. Finalmente, en la etapa de aclimatación, el 96% de las plantas trasplantadas sobrevivieron y fueron trasladadas a su hábitat natural. Con respecto a la determinación preliminar de compuestos fenólicos y actividad antioxidante, los extractos tuvieron una actividad antioxidante moderada en comparación con otras especies del género. Además, el incremento de esta actividad se correlacionó significativamente con la concentración de compuestos fenólicos, que aumentaron significativamente con niveles más altos de BAP. Por lo tanto, gracias a este ensayo establecimos un protocolo de micropropagación que puede ser utilizado como estrategia de conservación ex-situ de E. viviparum. Además, la especie mostro potencial fitoquímico y es de gran interés estudiar en profundidad sus compuestos fenólicos y las bioactividades relacionadas. Así, la última parte de este trabajo evaluó la composición fenólica de las partes aéreas y raíces de plantas de E. viviparum provenientes de cultivo in vitro. Asimismo, se evaluaron las actividades biológicas antioxidantes, citotóxicas y antimicrobianas (antibacterianas y antifúngicas). Para estas determinaciones, las muestras aéreas y radiculares del medio MS sin citoquininas se sometieron a una extracción sólido-líquido en una solución hidroetanólica (80:20; v/v) que fue utilizada para las posteriores determinaciones. La determinación de compuestos fenólicos se realizó mediante HPLC-DAD-ESI / MSn. La actividad antioxidante se determinó mediante dos ensayos específicos basados en células. El primer ensayo antioxidante se realizó a través del método de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). Este método mide la concentración a la que los extractos pueden prevenir la formación de malondialdehído (MDA) a través de la donación de átomos de hidrógeno a las especies radicales peroxilo formadas durante la oxidación lipídica en las células (en este ensayo, células de cerebro de cerdo). El segundo ensayo utilizado fue el método de inhibición del hemólisis oxidativa (OxHLIA). Este ensayo establece el tiempo y la concentración a la que los antioxidantes pueden retrasar la hemólisis de los eritrocitos utilizados, al capturar los radicales hidrófilos y / o lipófilos en las membranas de eritrocitos de ovejas. La actividad citotóxica se determinó mediante el método de sulforrodamina B en cuatro líneas de células tumorales, NCI-H460 (carcinoma pulmonar de células no pequeñas), MCF-7 (adenocarcinoma de mama), HeLa (carcinoma cervical) y HepG2 (carcinoma hepatocelular). Los extractos también se probaron para determinar su actividad hepatotóxica en una línea celular de hígado porcino no tumoral (PLP2). Finalmente, se utilizó el método de microdilución para determinar la actividad antibacteriana utilizando varias bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, y la actividad antifúngica para los hongos Micromycetes. Durante la determinación de compuestos fenólicos se identificaron 14 compuestos de las partes aéreas y raíces cultivadas in vitro de E. viviparum. Diez de estos compuestos fueron ácidos fenólicos y 4 flavonoides, siendo los primeros los principales compuestos fenólicos en ambos órganos (38,3 mg g-1 en las partes aéreas y 102 mg g-1 en las raíces). El principal compuesto cuantificado fue el ácido trans rosmarínico, que representó más del 70 % de todos los compuestos fenólicos identificados, en ambos órganos. Este compuesto es conocido por su alta capacidad antioxidante, antimicrobiana y anticancerígena, así como por sus efectos neuro y / o cardioprotectores. Aunque se identificaron flavonoides en ambos órganos, solo se cuantificaron en la parte aérea, siendo la tectorigenina -O- glucurónido, el flavonoide mayoritario identificado. En cuanto a las determinaciones de la actividad antioxidante, los resultados de OxHLIA mostraron la concentración de extracto necesaria para proteger la hemolisis del 50 % de la población de eritrocitos. Dado que los extractos contienen diferentes moléculas que ofrecen protección en diferentes períodos, los valores se midieron para Δt de 30 y 60 minutos. Los extractos de E. viviparum mostraron una protección moderada en comparación con el antioxidante sintético utilizado como control, Trolox, siendo el extracto de raíz el más eficaz para ambos intervalos. En cuanto al ensayo TBARS, los resultados revelaron la concentración de extracto necesaria para inhibir la formación de especies reactivas producidas durante el proceso de peroxidación lipídica. La capacidad antioxidante en este ensayo también fue mayor para el extracto de raíz, pero menos efectiva que Trolox. Las plantas son esenciales para muchos procesos vitales en la tierra, sin embargo, su tasa de extinción ha mostrado un aumento exponencial, en los últimos años, nunca antes estudiado. Además de los procesos de vida que llevan a cabo, las plantas son fuente de múltiples metabolitos minoritarios que se utilizan para su interacción con otras plantas y con el medio que las rodea. Estos compuestos, conocidos como metabolitos secundarios, también están asociados con múltiples actividades biológicas deseables para los seres humanos. Así, las plantas que contienen estos metabolitos se han utilizado durante décadas para el bienestar humano a través de la medicina tradicional y hoy en día para muchas aplicaciones de interés en diversas industrias. Por tanto, la acción coordinada para la conservación de las especies vegetales parece importante, no solo por sus procesos vitales de los que podemos beneficiarnos, sino también, porque podrían ser rentables como fuentes productivas de compuestos ya conocidos o para el descubrimiento de nuevos que puedan ser explotados. En el caso de E. viviparum, su actividad antioxidante muestra que el extracto de raíz en ambas pruebas podría estar correlacionada con los compuestos del ácido cafeico y rosmarínico, que tienen una alta capacidad antioxidante y fueron encontrados en altas concentraciones en este órgano. Con respecto a los resultados de citotoxicidad, estos mostraron que las células del carcinoma hepatocelular (HepG2) eran las más susceptibles a los extractos de E. viviparum y que se requería una concentración baja para inhibir el 50% de su crecimiento sin presentar toxicidad, en el rango de concentraciones ensayadas, en las células no cancerígenas del hígado (PLP2). Sin embargo, los extractos no fueron efectivos contra las células de carcinoma cervical (HeLa). Finalmente, durante los ensayos antimicrobianos, las bacterias gram negativas fueron las más sensibles a los extractos probados. Por un lado, el extracto de raíz fue más eficaz contra las cepas de Bacillus cereus y E. coli, aisladas de alimentos y ATCC 25922, respectivamente. Asimismo, el extracto de parte aérea fue muy efectivo contra Salmonella typhimurium, presentando una menor inhibición y concentraciones bactericidas en comparación con el control positivo ampicilina. El extracto de raíz fue más eficaz que el ketoconazol (control antifúngico) en la inhibición del crecimiento y la eliminación de colonias de Penicillium ochrochloron (ATCC 9112). Por último, P. funiculosum y P. verrucosum var. cyclopium fueron las cepas de hongos más susceptibles a ambos extractos, requiriendo una menor concentración de extracto para inhibir el crecimiento y matarlos en comparación con las otras colonias testadas. Por todo ello, la última parte de la presente tesis caracterizó a esta especie in vitro, como una interesante fuente de compuestos fenólicos, particularmente sus raíces, que contienen ácido trans rosmarínico y ácido trans 3-O-cafeoilquínico en alta concentración. Del mismo modo, el extracto de raíz también presentó alta actividad antioxidante, citotoxicidad moderada en las diferentes líneas de células tumorales probadas y ninguna hepatotoxicidad en células de hígado porcino no tumorales (PLP2). Además, también mostró mejores resultados en actividad antimicrobiana que el extracto de las partes aéreas, siendo más efectivo contra P. ochrochloron que los controles positivos utilizados durante este ensayo. En conjunto, este estudio destaca el interés en la conservación de esta especie debido a la presencia de diferentes compuestos fenólicos de interés, que aportan propiedades antioxidantes y antimicrobianas que pueden ser de utilidad para diversas bio-industrias. Así, esta tesis describe con éxito, por primera vez, una estrategia integrada para la conservación ex situ de Eryngium viviparum mediante procedimientos de germinación y cultivo in vitro, añadiendo un nuevo enfoque, a través de la investigación de posibles metabolitos secundarios con diversas actividades biológicas que agreguen un valor extra a la especie de estudio y a su proceso de conservación.