Inmovilización de transaminasas y amonio liasas y su aplicación en síntesis de compuestos aminados

Resumo

El objetivo del presente trabajo de tesis es establecer métodos biocatalíticos para la síntesis de los aminoácidos L-fenilalanina, L-aspartato, ??aminobutirato y de las aminas aromáticas 1-feniletilamina y 3-amino-1-fenilbutano, usando biocatalizadores con actividad transaminasa y amonio liasa inmovilizados por técnicas de formación de enlaces covalentes (en el caso de enzimas) y por atrapamiento (tanto para enzimas como para células). Se establecieron dos métodos enzimáticos para la síntesis del aminoácido aromático esencial L-fenilalanina (Phe). El primer método de síntesis se realizó usando como biocatalizador L-aspartato transaminasa (AAT) de corazón porcino inmovilizado. Se optimizaron los métodos de inmovilización de AAT en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados resultantes se emplearon en la síntesis de Phe. La inmovilización en Eupergit® C y LentiKats® permitió mejorar la estabilidad del enzima AAT, así como alcanzar rendimientos de reacción de síntesis de Phe superiores al 70%. Además se estableció un método de síntesis multienzimática “one-pot”, para lo que se acoplaron las reacciones catalizadas por los enzimas aspartasa (AspB) y transaminasa (AT). Se determinó la compatibilidad de los enzimas en las condiciones de reacción (pH 7,5 y 37°C) y se establecieron las concentraciones óptimas de los sustratos (0,15 M de fumarato, 0,3 M de NH4Cl y 0,1 M de fenilpiruvato) y de los enzimas (0,3 U de AspB/mL y 2 U de AT/mL). En estas condiciones, se alcanzó un rendimiento global de reacción de 80%. Para la síntesis de L-aspartato (Asp) se utilizó el enzima L-aspartato amonio liasa o aspartasa (AspB) de Bacillus sp. YM55-1 parcialmente purificado. El enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados se emplearon en la síntesis de altas concentraciones de Asp (? 60 g/L). Además, el enzima inmovilizado se reutilizó eficientemente en la síntesis del aminoácido, manteniendo alrededor del 90% de su actividad inicial al cabo de 5 ciclos de reacción en todos los casos. La síntesis de las aminas aromáticas 1-feniletilamina (FEA) y 3-amino-1-fenilbutano (AFB) se llevó a cabo utilizando biocatalizadores (células y/o enzima parcialmente purificado) con actividad ??transaminasa (??TA). Se estableció un método de permeabilización de las membranas de células ??TA utilizando bromuro de cetrimonio (CTAB). Las células ??TA se inmovilizaron en el soporte LentiKats® con un 100% de retención de su actividad catalítica. El enzima ??TA se inmovilizó en varios soportes, obteniéndose los mejores resultados en Eupergit® CM y LentiKats®. La inmovilización en LentiKats®, tanto de células (no permeabilizadas y permeabilizadas) como del enzima, permitió la reutilización de los catalizadores hasta en 5 y 10 ciclos de síntesis de AFB, manteniendo alrededor del 80 y 70% de la actividad inicial, respectivamente. Por último, se comprobó que el enzima aspartasa mutado (AspB-C6) a partir de AspB, cataliza la reacción de aminación regioselectiva del ácido crotónico para producir ??aminobutirato. Este enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C y MANA-agarosa según los métodos de inmovilización establecidos para el enzima AspB en los mismos soportes. Se obtuvieron rendimientos de inmovilización similares pero las actividades retenidas fueron significativamente inferiores para AspB-C6 que para AspB.