Study of the inclusion of biosurfactants in the agri-food industry to obtain more biocompatible formulations

Resumo

Los surfactantes son sustancias conocidas por su capacidad para reducir la tensión superficial entre las interfases de sistemas inmiscibles, siendo características de estos compuestos sus dos secciones hidrofílica (cabeza) e hidrofóbica (cola), lo que les confiere importantes propiedades como agentes emulsionantes a la hora de disolver otras sustancias que sean insolubles en mezclas. La mayor parte de los surfactantes que se comercializan actualmente se obtienen por síntesis química a partir de fuentes no renovables como son los derivados de petróleo. Además de este tipo de surfactantes denominados sintéticos, hay otra clase de surfactantes obtenidos también por síntesis química - surfactantes bio-based - pero cuyo origen se basa en fuentes renovables como aminoácidos, grasas o azúcares, tanto vegetales como animales. De manera general, los surfactantes se suelen clasificar en base a su carga iónica en catiónicos, aniónicos, no iónicos y anfotéricos. En función de su carga, estas moléculas presentan distintas propiedades que les confieren la capacidad de poder ser incorporados en diferentes aplicaciones a nivel industrial, desde productos para limpieza como en formulaciones de productos de la industria farmacéutica, cosmética, médica o agroalimentaria. Por el contrario, los surfactantes sintéticos presentan algunos inconvenientes debido a su toxicidad e irritabilidad, pudiendo provocar problemas de irritación en piel o alergias. En el caso de los surfactantes bio-based, su obtención, aún a partir de fuentes renovables, lleva asociado importantes consecuencias medioambientales sobre los ecosistemas naturales. Estos inconvenientes han derivado en los últimos años en la búsqueda de compuestos más biocompatibles y biodegradables para ser utilizados en formulaciones en la industria cosmética, farmacéutica o agroalimentaria con el objetivo de disminuir su impacto en la salud del ser humano además de reducir y poder eliminar la huella que la explotación de estos compuestos sintetizados químicamente deja sobre el medio ambiente. Por ello, recientes investigaciones han fijado su atención en un nuevo tipo de surfactantes, de origen microbiano, más conocidos como biosurfactantes. Estos compuestos, obtenidos a partir de procesos biotecnológicos, como pueden ser las fermentaciones microbianas, presentan características más biocompatibles y biodegradables, además de ser menos tóxicos que los surfactantes obtenidos por síntesis química, y están formados por moléculas como azúcares, lípidos y/o proteínas. Sin embargo, presentan el inconveniente de que su producción supone un alto coste de cara a una comercialización en diferentes ámbitos de la industria. Nuevos proyectos estudian la manera de poder optimizar su producción, reduciendo costes para que puedan ser competitivos en el mercado frente a los surfactantes sintéticos y los bio-based. De esta manera, diversas investigaciones están llevando a cabo el uso de residuos agroindustriales, así como otras fuentes de carbono para estudiar la obtención de biosurfactantes a bajo coste y con altos rendimientos, dándole un valor añadido a residuos derivados de industrias como la vinícola o la del maíz, entre otras. Entre las posibles fuentes de obtención de biosurfactantes a partir de residuos agroindustriales, los licores de lavado de maíz están captando una importante atención como una fuente muy prometedora para la producción de biosurfactantes para su aplicación con fines industriales. Estos licores de lavado de maíz o corn steep liquor (CSL), como son conocidos en inglés, son una corriente residual acuosa obtenida tras el fraccionamiento del maíz por vía húmeda con SO2 bajo condiciones ácidas a temperaturas en torno a los 50 ºC. Debido a su alto contenido en nutrientes, estas corrientes de licores de lavado de maíz se utilizan como suplementos en diversos procesos biotecnológicos, así como piensos utilizados para alimentación animal. Durante la última década, el grupo EQ10 del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Vigo ha descubierto la presencia de extractos biosurfactantes en estas corrientes residuales, provenientes de la industria del maíz, por la fermentación espontánea de estas durante las etapas de fraccionamiento de maíz. Este hallazgo y la optimización de los procesos de extracción de estos extractos les ha permitido obtener varias patentes, algunas de ellas licenciadas actualmente a una empresa internacional. Conviene resaltar que, debido a la fermentación espontánea de microorganismos presentes en esta corriente acuosa, se reducen los costes de producción de los extractos biosurfactantes, no teniendo que utilizar procesos biotecnológicos basados en fermentaciones, y, por ello, abriendo una puerta a su explotación a nivel industrial, pudiendo competir a nivel de coste de producción con sus homólogos surfactantes de origen sintético y bio-based. Sin embargo, son necesarios nuevos proyectos de investigación para poder estudiar sus propiedades y posibles aplicaciones, además de identificar los microorganismos responsables de su producción en CSL e impulsar su incorporación en futuras formulaciones cosméticas y farmacéuticas, donde se han llevado a cabo varios trabajos, y, especialmente en la industria agroalimentaria, donde las características de los extractos biosurfactantes aún no han sido estudiadas. Por ello, esta Tesis Doctoral tiene como objetivo aislar, caracterizar e identificar el microorganismo responsable de la producción de extractos biosurfactantes en las corrientes de lavado de maíz, así como la evaluación y caracterización de las propiedades de los extractos biosurfactantes en diferentes aplicaciones para su incorporación en el ámbito agroalimentario y agroquímico, estudiando su inclusión como agentes antimicrobianos o emulsionantes. El creciente interés en compuestos obtenidos a partir de procesos biológicos de carácter biodegradable y más biocompatibles ha impulsado el potencial de estos extractos, no solo por su amplia gama de posibles usos en la industria sino también a la hora de revalorizar y aportar un valor añadido a una corriente residual, en este caso de la industria del maíz, como lo son los licores de lavado de maíz. Debido a este motivo, se citan a continuación los objetivos definidos en esta Tesis Doctoral: 1. Aislamiento y caracterización del microorganismo responsable de la producción espontánea de compuestos biosurfactantes en los licores de lavado de maíz (CSL), así como la extracción y caracterización de los extractos biosurfactantes, extracelulares y ligados a su membrana, obtenidos a partir del microorganismo aislado de CSL. 2. Identificación genética del microorganismo responsable de la producción espontánea de compuestos biosurfactantes en CSL. 3. Extracción de extractos biosurfactantes procedentes de CSL con disolventes orgánicos, cuya utilización sea compatible dentro de la industria agroalimentaria y agroquímica, como es el caso del acetato de etilo. 4. Evaluación de extractos biosurfactantes procedentes de CSL como agentes antimicrobianos frente a cepas bacterianas patógenas de la industria agroalimentaria. 5. Efecto de los extractos biosurfactantes procedentes de CSL sobre bacterias probióticas de yogures fermentados bebibles. 6. Incorporación de extractos biosurfactantes procedentes de CSL en formulaciones agroquímicas, para la obtención de pesticidas más respetuosos con el medio ambiente. 7. Desarrollo y optimización de la extracción de los extractos biosurfactantes ligados a la membrana de la biomasa contenida en CSL. Para lograr la consecución de estos objetivos, la Tesis se divide en tres diferentes bloques. El primer bloque se basa en el aislamiento, caracterización e identificación del microorganismo productor, de manera espontánea, de extractos biosurfactantes procedentes de CSL. Se realizó la extracción y caracterización de los extractos biosurfactantes obtenidos a partir de la cepa aislada, tanto los extracelulares como los ligados a su membrana. Para ello, los licores de lavado de maíz fueron inoculados e incubados en medios de cultivo selectivos, donde se aislaron las colonias del microorganismo productor de los extractos biosurfactantes. El microorganismo aislado ha sido caracterizado como una especie Bacillus gram-positiva. Además, se realizó una evaluación macroscópica, dando como resultando ser una cepa bacteriana catalasa-negativa y formadora de endosporas. Esta cepa de género Bacillus fue capaz de producir extractos biosurfactantes extracelulares y ligados a la membrana. Fueron capaces de reducir la tensión superficial del agua en valores comprendidos entre 43.2 y 52.3 mN/m. La apariencia de ambos extractos presentó diferencias en el aspecto, siendo el extracelular de apariencia aceitosa mientras que el ligado a la membrana presentaba un aspecto de polvo blanco. Respecto a los resultados obtenidos en su análisis elemental, los compuestos extracelulares presentaron un valor de entre el 32-40% de C, siendo más reducido, en torno al 24%, para los extractos ligados a la membrana. Los valores de N para ambos extractos estuvieron comprendidos entre 4.86-7.98%, para el H, entre 3.73-6.93%, y de <0.30% en el caso del S. Para realizar una caracterización más completa, se comparó una espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR por sus siglas en inglés) de los dos extractos con la de un biosurfactante comercial (fengicina) resultando en una alta similitud en los espectros obtenidos. Adicionalmente, mediante análisis de espectrometría de masas (ESI-MS) se observó que ambos extractos biosurfactantes estaban compuestos por una mezcla de lipopéptidos conteniendo ácidos grasos C16 y C18. Por último, se evaluó el efecto antimicrobiano de la cepa de Bacillus aislada de CSL frente a cepas patógenas como Candida albicans, Aspergillus niger y Staphylococcus aureus logrando inhibir su crecimiento en medios de cultivo selectivos. Para completar este primer bloque, el microorganismo aislado de los licores de lavado de maíz fue analizado genéticamente a partir de una amplificación y análisis de secuencia del gen 16S rRNA donde fue identificado como Aneurinibacillus aneurinilyticus. Con ello, se confirmaba por primera vez la identificación del microorganismo productor de extractos biosurfactantes en CSL de manera espontánea. En el segundo bloque, se evaluó la extracción de extractos biosurfactantes a partir de CSL con disolventes orgánicos compatibles para la industria agroalimentaria y agroquímica como el acetato de etilo, cuyo uso está permitido por la Unión Europea (UE) para aplicaciones en los citados ámbitos industriales. Para su obtención, se llevaron a cabo extracciones líquido-líquido (L-L), optimizadas previamente por el grupo de investigación EQ10 del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Vigo. El extracto obtenido a partir de CSL con acetato de etilo redujo la tensión superficial del agua hasta valores de 37.3 a 44.3 mN/m, con resultados de concentración crítica micelar (CMC por sus siglas en inglés) en el rango entre 130.2-442.1 mg/L, dependiendo del lote de CSL y su origen. Respecto al análisis elemental, se obtuvieron valores de 56.32% de C, 9.67% de H, 0.98% de N y <0.30% de S. Por último, se estudió la presencia de fosfolípidos, obteniendo porcentajes del 0.11%. A continuación, se realizaron una serie de estudios basados en las propiedades del extracto biosurfactante extraído con acetato de etilo a partir de CSL para la inclusión de estos compuestos en diferentes aplicaciones industriales. El primero de ellos fue evaluar su capacidad antimicrobiana. Las contaminaciones microbianas son responsables de la pérdida de toneladas de productos alimenticios cada año, afectando en cualquiera de las etapas del sistema de cadena alimentario. Varias de estas contaminaciones pueden tener repercusión en la salud de seres humanos y animales y, los biosurfactantes, que en estudios previos han demostrado tener capacidad antimicrobiana frente a varios patógenos, aparecen como una opción importante para su inclusión y su utilización en varias áreas industriales como agentes antimicrobianos. Debido a ello, en esta tesis se evaluó la capacidad antimicrobiana de un extracto biosurfactante obtenido de CSL y extraído con acetato de etilo, como previamente se ha mencionado, frente a cepas bacterianas patógenas como Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Los resultados corroboraron la actividad antimicrobiana del extracto obtenido a partir de CSL frente a ambas cepas, especialmente tras realizar una etapa de filtración con membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de los extractos biosurfactantes, lográndose un efecto bactericida para concentraciones del extracto menores de 1 g/L tras 24 h de incubación. Estos experimentos demostraron la capacidad de los extractos biosurfactantes obtenidos a partir de CSL para su posible aplicación como agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas como P. aeruginosa y E. coli. A continuación, se estudió el efecto del extracto biosurfactante de CSL sobre cepas probióticas de Lactobacillus casei contenidas en un yogur bebible, además de evaluar el consumo de azúcares y la producción de ácidos láctico y acético de L. casei por la presencia del extracto biosurfactante. Los resultados demostraron que el crecimiento de la bacteria probiótica contenida en el yogur bebible no se vio afectado por la inclusión del extracto biosurfactante, sino que este tuvo un efecto positivo para el desarrollo de L. casei, especialmente en las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa bacteriana. Un análisis estadístico, en el que se analizaron la producción de biomasa de L. casei en unidades formadoras de colonias (CFU) por mL, y la producción en g/L de lactosa, glucosa, galactosa, ácido láctico y ácido acético a distintas concentraciones del extracto biosurfactante, temperaturas y tiempos de incubación; revelaron que la adición del extracto biosurfactante de CSL tuvo un efecto significativo en la producción de biomasa por parte de L. casei. Además, la producción de azúcares no se vio afectada, no alterando el desarrollo de la cepa probiótica. Por ello, el extracto biosurfactante obtenido a partir de CSL con acetato de etilo podría ser considerado para su inclusión en aplicaciones de la industria agroalimentaria como un compuesto con capacidad prebiótica a la hora de promover las capacidades probióticas de bacterias como L. casei presentes en yogures bebibles. Además de la capacidad antimicrobiana y prebiótica del biosurfactante objeto de estudio de esta Tesis, se realizaron varios experimentos para evaluar la capacidad solubilizante del extracto obtenido a partir de CSL sobre principios activos de pesticidas basados en cobre. En los últimos años, la UE ha ido limitando el uso de pesticidas basados en cobre, impulsando a la industria a desarrollar nuevas formulaciones reduciéndose el uso de aquellos que son perjudiciales para el medio ambiente, introduciendo nuevos compuestos más biodegradables. Esto supone una vía importante para la introducción de biosurfactantes en formulaciones pesticidas, debido a su alta capacidad emulsionante, en conjunto con sus capacidades antimicrobianas, pudiendo en un futuro reducir la concentración o incluso sustituir a aquellos principios activos poco respetuosos con el medio ambiente. Por ello, se realizaron estudios incorporando biosurfactantes extraídos a partir de CSL con cloroformo y acetato de etilo en formulaciones con principios activos basados en cobre como el oxicloruro de cobre (Cu-Oxy) y el óxido cuproso (Cu-Ox). El extracto biosurfactante obtenido con acetato de etilo resultó tener una mayor capacidad solubilizante de ambos principios activos en comparación con el extracto obtenido a partir de CSL con cloroformo. Se observó que la presencia de fosfolípidos, en una mayor cantidad en el extracto obtenido con cloroformo (8.15%) frente al extraído con acetato de etilo (0.11%), podría limitar la capacidad solubilizante de los principios activos basados en cobre. Además, se compararon estos resultados con surfactantes comerciales, siendo estos últimos incapaces de solubilizar más del 1% de ambos principios activos, Cu-Oxy y Cu-Ox, mientras que los extractos biosurfactantes fueron capaces de solubilizar hasta un 90% de Cu-Oxy y un 13% de Cu-Ox, respectivamente. Posteriormente, se llevaron a cabo estudios estadísticos con el extracto biosurfactante obtenido a partir de CSL con acetato de etilo, debido a haberse obtenido mejores resultados, con el objetivo de obtener las condiciones óptimas para la solubilización de Cu-Oxy y Cu-Ox. Estos experimentos se llevaron a cabo a distintas concentraciones del extracto biosurfactante, a diferentes concentraciones de los principios activos de cobre, en relación a las concentraciones máximas permitidas para los mismos en las regulaciones actuales de pesticidas basados en cobre, y, a distintos tiempos de agitación de las soluciones acuosas. Los resultados demostraron la influencia de la adición del extracto biosurfactante para la solubilización de ambos principios activos, resultando ser la variable más significativa del análisis. Estos resultados permitieron determinar ecuaciones teóricas con el objetivo de predecir la solubilización de los dos principios activos de cobre, Cu-Oxy y Cu-Ox, dentro de los rangos de concentraciones establecidos para el análisis estadístico. Estas ecuaciones nos permitieron obtener las condiciones óptimas de solubilización, alcanzándose valores del 96.5% de cobre disuelto a partir del principio activo de Cu-Oxy a concentraciones de 16.1 g/L del extracto biosurfactante de CSL y 2.4 g/L de Cu-Oxy, después de 20 min de tiempo de contacto en agitación de la disolución acuosa. Por otro lado, para el caso de Cu-Ox, estos resultados fueron más bajos, obteniendo un máximo de 13.2% de cobre disuelto a concentraciones de 3.93 g/L del extracto biosurfactante de CSL para concentraciones de 1.96 g/L de Cu-Ox después de 20 min de agitación. Además de estos análisis, se estudió la distribución del tamaño de partícula para evaluar las diferencias de solubilización de ambos principios activos por parte del extracto biosurfactante de CSL. Se observó que el tamaño de las partículas en las soluciones de extracto biosurfactante y Cu-Ox eran 10 veces más grandes que para las disoluciones con Cu-Oxy a la misma concentración, lo que puede estar relacionado con la formación de micelas en el caso de las soluciones con Cu-Ox en contraste con la formación de complejos de ligandos metálicos en las soluciones de Cu-Oxy, siendo estos últimos de un menor tamaño y, por lo tanto, permitiendo una mejor solubilización de este principio activo basado en cobre. En base a estos resultados, se comprobó la capacidad solubilizante de extractos biosurfactantes obtenidos a partir de CSL, logrando mucho mejores resultados que los surfactantes comerciales, que apenas fueron capaces de solubilizar ambos principios activos. Estos estudios permiten corroborar la posible utilización de estos biosurfactantes extraídos a partir de CSL para su incorporación en nuevas formulaciones de pesticidas más respetuosos con el medio ambiente, reduciendo la concentración necesaria a añadir en estas soluciones de los principios activos basados en cobre. Por último, el tercer bloque de esta Tesis Doctoral se centró en el estudio del proceso de extracción de los extractos biosurfactantes ligados a la membrana de la biomasa contenida en el CSL, una vez que, en el primer bloque previamente mencionado, se identificó la cepa productora de los extractos biosurfactantes como Aneurinibacillus aneurinilyticus, siendo además capaz de producir tanto extractos biosurfactantes extracelulares como ligados a su membrana. Se desarrolló un nuevo método de extracción, a partir de la biomasa contenida en CSL, usando soluciones acuosas de tampón y que llevaron a la obtención de una patente a nivel internacional basada en el proceso de extracción, además de en los usos de los extractos biosurfactantes obtenidos para aplicaciones en la industria cosmética, farmacéutica, agroalimentaria, agroquímica y medioambiental. En esta patente, se reivindican los usos de los extractos biosurfactantes, obtenidos por extracción acuosa a partir de CSL a nivel industrial, como emulsificante, agente surfactante, agente emulsionante o estabilizante de principios activos de soluciones acuosas, así como agente de limpieza de superficies. En base a los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, se puede considerar que el extracto biosurfactante obtenido a partir de CSL, producido espontáneamente en la corriente acuosa procedente de la industria del maíz, CSL, por la cepa Aneurinibacillus aneurinilyticus, como se ha identificado en esta Tesis, es una alternativa importante y ventajosa frente a los surfactantes obtenidos por síntesis química, para su uso en aplicaciones de la industria agroalimentaria y agroquímica, como agente antimicrobiano, compuesto con capacidad prebiótica y agente solubilizante de principios activos de pesticidas basados en cobre. Además, se trata de una opción rentable a nivel económico, por ser un compuesto obtenido a partir de residuos agroindustriales con extracciones de bajo coste en comparación con otras biosurfactantes estudiados anteriormente. A continuación se resumen los principales trabajos y logros conseguidos en esta Tesis Doctoral: 1. Se ha aislado, caracterizado e identificado genéticamente el microorganismo responsable de la producción de extractos biosurfactantes en los licores de lavado de maíz (CSL) como Aneurinibacillus aneurinilyticus. De igual forma, se han caracterizado los extractos biosurfactantes producidos por esta cepa, tanto extracelulares como ligados a su membrana presentando características tenso activas semejantes a los extractos obtenidos directamente a partir de CSL. 2. Se ha utilizado un disolvente orgánico, compatible con su uso dentro de la industria agroalimentaria y agroquímica, como es el acetato de etilo, para la extracción L-L del extracto biosurfactante procedente de CSL , abriendo la puerta a la obtención y uso de estos extractos a nivel industrial. 3. Se ha demostrado la capacidad antimicrobiana del extracto biosurfactante procedente de CSL frente a bacterias patógenas de la industria agroalimentaria como P. aeruginosa y E. coli, presentando efectos bactericidas a concentraciones cercanas a 1 g/L tras un paso previo de filtración con membranas PVDF. 4. Se ha evaluado la capacidad del extracto biosurfactante de CSL como agente con capacidad prebiótica potenciando el crecimiento de bacterias probióticas presentes en yogures bebibles. 5. Además, se ha demostrado la capacidad solubilizante del extracto procedente de CSL, de principios activos basados en cobre, como Cu-Oxy y Cu-Ox, abriendo la puerta a su incorporación en formulaciones biopesticidas, reduciendo el uso de estos principios activos, ya que este extracto es capaz de solubilizar más de un 90% de Cu-Oxy y más de 13% de Cu-Ox, en comparación con la casi nula capacidad de los surfactantes comerciales evaluados para solubilizar Cu-Oxy y Cu-Ox. 6. Por último, se ha desarrollado un nuevo método de extracción de extractos biosurfactantes ligados a la membrana de la biomasa presente en el CSL, resultando en la obtención de una patente a nivel internacional para la extracción y usos de estos extractos en diversas aplicaciones de la industria cosmética, farmacéutica, agroalimentaria, agroquímica y medioambiental.